[发明专利]一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法

说明书

本发明公开了一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法，所述方法包括：对耐热纤维素酶中保守的N‑糖基化序列N88‑E89‑T90和底物结合区中保守的非催化氨基酸Y173进行定点突变，将第90位苏氨酸突变为丙氨酸，将第173位酪氨酸突变为苯丙氨酸。本发明对耐热纤维素内切酶CTendo45保守的N‑糖基化序列和底物结合区中保守的非催化氨基酸进行了定点突变，突变后的耐热纤维素酶突变酶的酶活力大幅提升，并且在高温条件下的热稳定性明显改善。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法。

背景技术

面对石化能源稀缺和环境污染带来的双重压力，世界各国高度重视开发和利用生物质能源替代传统能源。利用纤维素酶转化木质纤维素生物质，对解决能源危机和环境污染问题具有重要的战略意义。纤维素内切酶(EC 3.2.1.4)是一种能够随机水解纤维素链中β-1,4-糖苷键，并产生纤维寡糖的糖苷水解酶。纤维素内切酶是商品化纤维素酶制剂的主要来源。

目前，商品酶制剂主要是中温酶。但是，在高温条件下热稳定性差、易失活，导致工业生产中酶用量增加、成本提升，严重制约了纤维素酶的推广应用。由于耐热纤维素酶在高温条件下具有出色的热稳定性和高催化效率，可有效减少生产中酶的投入成本，更加适合工业开发和应用。酶活力和热稳定性是耐热酶的内在功能特征，主要取决于酶蛋白结构。以蛋白结构分析为基础的酶定向改造，是提升酶学特性最有效的方法之一。但是，由于酶蛋白空间结构极其复杂，目前成功预测重要结构域功能并有效改良酶学特性的成功率不足10％。因此，探寻一种高效可行的纤维素酶改良方法以提高酶酶活力和热稳定性，对提升耐热纤维素酶在食品加工、酿造业、造纸工业、纺织业和燃料乙醇炼制等领域的工业应用价值具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法。本发明对耐热纤维素内切酶CTendo45保守的N-糖基化序列和底物结合区中保守的非催化氨基酸进行了定点突变，突变后的耐热纤维素酶突变酶的酶活力大幅提升，并且在高温条件下的热稳定性明显改善。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种提升耐热纤维素酶酶活力和热稳定性的方法，所述方法包括：对耐热纤维素酶中保守的N-糖基化序列N88-E89-T90和酶底物结合区中保守的非催化氨基酸Y173进行定点突变，将第90位苏氨酸突变为丙氨酸，将第173位酪氨酸突变为苯丙氨酸。

本发明的第二方面，提供上述方法在制备耐热纤维素酶突变体中的用途；所述耐热纤维素酶突变体的酶活力和热稳定性均高于原始酶。

本发明的第三方面，提供一种酶活力和热稳定性提高的耐热纤维素酶突变体，所述耐热纤维素酶突变体是对嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)中第45家族的耐热纤维素内切酶CTendo45进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为第90位的Thr和第173位的Tyr。

优选的，所述第90位的Thr突变为Ala，所述第173位的Tyr突变为Phe。

优选的，所述耐热纤维素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第四方面，提供上述耐热纤维素酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用北京全式金生物技术有限公司生产的定点突变试剂盒(FastMutagenesisSystem Kit)引入目的突变氨基酸位点，扩增得到两端带有EcoRI和NotI酶切位点的突变酶扩增产物，将突变酶扩增产物连接至已双酶切的酵母表达载体pPIC9K上，获得携带目的基因的酵母表达载体；

(2)将携带目的基因的酵母表达载体进行线性化和去磷酸化处理，然后转化酵母感受态细胞，获得酵母工程菌；