[发明专利]一种猪旋毛虫病上转发光诊断试剂盒

说明书

本发明涉及一种猪旋毛虫病上转发光诊断试剂盒，属于生物领域。包括颗粒硅化及其羧基修饰，旋毛虫重组WM5制备，试剂盒的制备，在检测带T固定旋毛虫表达抗原RTWM5，在质控带C固定兔抗山羊IgG，将UCP‑NPs‑山羊抗猪IgG用结合物稀释液浇于结合垫，并烘干。优点是：该检测灵敏特异、操作简便、耗时短，为基层猪旋毛虫病的现场检测提供了参考，解决了目前胶体金试纸条因人为判读所造成的不确定性及误差的难题，实现屠宰生猪重要人兽共患旋毛虫病的活体检验，降低屠宰过程中胴体检验的压力及漏检率。

技术领域

本发明属于生物领域，尤其涉及人兽共患食源性旋毛虫病检测试剂盒。

背景技术

旋毛虫的发现已有170多年的历史，然而时至今日，理想的检验及诊断方法仍尚未找到。对于屠宰动物旋毛虫病的检验，国际通用方法为镜检法及集样消化法。然而以上两方法均存在一定的弊端，镜检法费时费力而且敏感性差，其敏感性为肉中虫体密度达到每克3条虫体时方可检出。集样消化法虽可大大提高检出率，将虫体检出率提高至每克肉1条虫体，但该方法仍十分繁琐，因此无法应用于猪旋毛虫病的活体诊断。免疫学方法如ELISA是目前最为敏感的方法，其敏感性可检测至每克肉0.01条虫体即每公斤肉含虫量少于10条,这一敏感性可完全确保肉类的安全，然而由于目前所广泛选用的基于虫体所获得的抗原如ES抗原、CAg和可溶性抗原等存在组分复杂、不利于大规模生产、制备过程繁琐等弊端，此外，还存在严重的交叉反应和诊断盲区(感染19天后无法检出)，因此免疫学方法始终未被纳入法规方法。

发明内容

本发明提供一种旋毛虫病上转发光诊断试剂盒，以解决目前人兽共患旋毛虫病检测中存在的费时费力、敏感性差的问题。

本发明采取的技术方案是：包括下列步骤：

(一)、颗粒硅化及其羧基修饰

(1)称取50mg的上转发光纳米颗粒UCP-NPs溶于16.7mL的异丙醇中；

(2)待样品均匀分散后，用超声仪对样品超声2min；

(3)42℃搅拌30min；

(4)缓缓加入84μL的四乙基原硅酸盐，继续搅拌1h；

(5)12000rpm/min，离心5min，用异丙醇清洗2次；

(6)加16.7mL异丙醇将清洗后的UCP-NPs颗粒重悬并超声30s；

(7)42℃搅拌30min；

(8)加16.7mL的单羧酸硅烷偶联剂，42℃搅拌3h；

(9)将反应体系全部蒸干；

(10)12000rpm/min，离心5min，用去离子水清洗2次；

(11)-20℃冻存；

(二)、旋毛虫重组WM5(RTWM5)制备

(1)重组蛋白的诱导表达

利用基因组学技术(cDNA表达文库及展示文库)及蛋白/抗原组学技术(2D双向电泳及肽库的免疫学筛选)，筛选旋毛虫肌幼虫高丰度抗原基因及抗原表位色氨酸蛋白酶抑制剂(WM5)，以此基因为基础，加入高效基因表达原件及限制性酶切位点并命名为RTWM5，具体基因序列如SEQ ID No.1所示；

将具有转化的重组子pET-28a-RTWM5的大肠杆菌，依次接种于5mL LB液体培养基、含100μL 50mg/mL卡那霉素中，170rpm/min、37℃震荡培养5h，将此5mL培养物转接于1L LB培养基、含1mL 50mg/mL Kan中，37℃培养至OD 600＝0.4～0.8时，加1mL 1mol/L IPTG，120rpm/min、37℃、6h振荡诱导培养；

(2)菌体离心