[发明专利]一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法

说明书

本发明公开了一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法，具体涉及细胞培养技术领域，具体分离和培养步骤如下：无菌条件下取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，用PBS反复冲洗，用眼科剪除去黏膜下组织，剪成小块，置于DispaseⅡ酶中，4℃过夜消化18h，用眼科镊分离上皮层，PBS液冲洗上皮层，将上皮剪切成小片加入混合消化液中，37℃消化7分钟，加胎牛血清终止消化，用吸管反复吹打至单细胞悬液，离心弃上清，加入无血清培养基，接种于培养瓶中倒置培养，当原代培养的细胞汇合率达70％‑80％时，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化并以1:2传代。本发明整个培养过程简单，得到的原代培养细胞成活率高，并且不易出现双核、多核、畸形核细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术技术领域，更具体地说，本发明涉及一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法。

背景技术

大多数口腔黏膜疾病的病因复杂，致病机理不详，为进一步研究口腔黏膜上皮细胞(Oralmucosaepithelialcells,OMECs)多因素、多步骤致病机制，建立人永生化OMECs细胞系是非常必要的。正常情况下，OMECs在体外仅能传代培养5-6代，无法满足研究需求。

因此，有学者进行了人永生化OMECs细胞系的探索，如HPV16E6E7诱导的永生化口腔粘膜上皮细胞系，但HE染色可见细胞大小不均一，出现双核、多核、畸形核细胞，结果不甚理想。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法，采用德国Merck Millipore公司提供的Human Epidermal KeratinocyteComplete Medium Kit无血清培养基培养，成功分离培养了原代OMECs，无成纤维细胞混杂，原代细胞接种3天后即可长满，细胞形态均一，密集排列呈“铺路石”样生长，符合上皮细胞体外培养的形态特征，且生长迅速。证实了此培养基可在短期内获得大量具有增殖能力的OMECs，能够满足后续实验需求，整个培养过程简单，得到的原代培养细胞成活率高，并且不易出现双核、多核、畸形核细胞。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，具体分离步骤如下：

S101、在无菌条件下，取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，将其放入烧杯容器内，然后使用50ml含1％双抗的PBS反复冲洗5遍，去除口腔黏膜组织表面的污垢和杂质；

S102、用眼科剪除去冲洗后的黏膜下组织，然后将剩余的黏膜上组织剪成2mm×1mm的小块，然后置于盛有2.5g/LDispaseⅡ酶的容器中，过夜消化；

S103、将步骤S102中过夜消化的黏膜组织用眼科镊分离上皮层，再用含1％双抗的PBS液冲洗上皮层，将口腔黏膜组织上皮层剪切成小片，然后再加入盛有混合消化液的容器中进行消化；

S104、向步骤S103的容器中加胎牛血清终止消化，再用吸管反复吹打至单细胞悬液；

S105、将单细胞悬液取出，将其倒入离心机内，对溶液进行离心，得到离心基液。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S101中，取多余口腔黏膜组织的唇裂整复术患者年龄为3个月。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S102中，口腔黏膜上组织过夜消化的环境温度为3-5℃，过夜消化时间为18h。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S103中，混合消化液具体为0.25％胰酶和0.02％EDTA，且0.25％胰酶：0.02％EDTA＝1：1。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S103中，口腔黏膜组织上皮层消化的环境温度为36-38℃，消化时间为7分钟。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S105中，单细胞悬液在离心机800rpm的速度下离心5min。