[发明专利]一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法

权利要求书

1.一种口腔黏膜上皮细胞的分离，其特征在于，具体分离步骤如下：

S101、在无菌条件下，取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，将其放入烧杯容器内，然后使用50ml含1％双抗的PBS反复冲洗5遍，去除口腔黏膜组织表面的污垢和杂质；

S102、用眼科剪除去冲洗后的黏膜下组织，然后将剩余的黏膜上组织剪成2mm×1mm的小块，然后置于盛有2.5g/LDispaseⅡ酶的容器中，过夜消化；

S103、将步骤S102中过夜消化的黏膜组织用眼科镊分离上皮层，再用含1％双抗的PBS液冲洗上皮层，将口腔黏膜组织上皮层剪切成小片，然后再加入盛有混合消化液的容器中进行消化；

S104、向步骤S103的容器中加胎牛血清终止消化，再用吸管反复吹打至单细胞悬液；

S105、将单细胞悬液取出，将其倒入离心机内，对溶液进行离心，得到离心基液。

2.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S101中，取多余口腔黏膜组织的唇裂整复术患者年龄为3个月。

3.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S102中，口腔黏膜上组织过夜消化的环境温度为3-5℃，过夜消化时间为18h。

4.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S103中，混合消化液具体为0.25％胰酶和0.02％EDTA，且0.25％胰酶：0.02％EDTA＝1：1。

5.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S103中，口腔黏膜组织上皮层消化的环境温度为36-38℃，消化时间为7分钟。

6.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤S105中，单细胞悬液在离心机800rpm的速度下离心5min。

7.基于权利要求1-6任意一项所述的口腔黏膜上皮细胞的分离方法的培养方法，其特征在于，具体培养步骤如下：

S201、单细胞悬液离心结束后，得到的离心基液弃上清，加入无血清培养基HumanEpidermalKeratinocyteCompleteMediumKit，并接种于25cm²培养瓶中，倒置培养3d；

S202、当步骤S201中原代培养的细胞汇合率达70％-80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，并以1：2传代。

8.根据权利要求7所述的一种口腔黏膜上皮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤S202中，原代培养的细胞还可以用0.02％EDTA进行消化。