[发明专利]一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种基于人稀有血清型腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法，其是以野生型腺病毒HAd49的基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I‑CeuI和PI‑SceI酶切位点，同时以人源腺病毒Ad5的E4orf6替换HAd49的E4orf6，提高了在人源肾胚细胞(HEK293)中包装重组病毒的成功率和包装出重组病毒的滴度,获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体Ad49。此表达载体可以用于表达多种不同种类的抗原，为疫苗和生物医药研发提供基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种用于基因治疗和疫苗载体研发的重组腺病毒载体；具体是本发明涉及基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法。

背景技术

腺病毒 （adenovirus, Ad）作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初，当科学家发现腺病毒基因组可与猴类病毒 40（SV40）基因组杂交，说明腺病毒基因组能接入异源性基因。此后腺病毒逐步发展为一种重要的载体系统。已有的研究证明，腺病毒载体疫苗可以在不同动物体内刺激诱导产生特异的T细胞和B细胞免疫应答，但是不同亚型的腺病毒感染和刺激能力是不相同。C亚群中的腺病毒诱导的针对外源基因的特异性T细胞免疫和B细胞免疫的反应最强。基于人腺病毒血清型5（Ad5）和2（Ad2）型的表达载体在疫苗研究以及治疗中被广泛应用，但是由于人体内预存的针对Ad5和Ad2腺病毒的免疫反应，从而抑制腺病毒感染机体细胞，导致其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的细胞免疫CTL反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。为了克服预存免疫反应对腺病毒载体的影响，需要从其它人体腺病毒血清型甚至其他动物种属中开发新的重组腺病毒载体。因此基于人稀有血清型腺病毒49（HAd49）的疫苗载体，其免疫效果显著且能够克服针对Ad5腺病毒的预存免疫反应。

现有技术中基于人稀有血清型腺病毒构建的疫苗载体，都需要在人源肾胚细胞中完成病毒的包装。但是，由于腺病毒亚型或者种属的差异性，包装出的重组病毒无论是滴度还是纯度都达不到临床使用的标准，而且跟包装出的Ad5病毒载体均有一定差距。

发明内容

为了弥补已有腺病毒表达载体的缺陷，本发明提供一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法，更加有利于包装出纯度和滴度更高的重组病毒。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体，其是以人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组为基础，通过直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-CeuI和PI-SceI酶切位点，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4编码区的开放阅读框6替换HAd49的基因组的相应阅读框，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体；其中，所述人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组的GenBank登录号为DQ393829.1，人血清型腺病毒Ad5的基因组的GenBank登录号为AY601635.1。

进一步地，所述的删除E1编码区是指删除人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第462-3362位的碱基序列。

进一步地，所述的删除E3编码区是指删除人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第26655-30736位的碱基序列。

进一步地，所述的HAd49的基因组的相应阅读框为人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组的E4编码区的开放阅读框6（E4orf6），具体为人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第32257-33389位的碱基序列。

进一步地，所述的人血清型腺病毒Ad5的E4编码区的开放阅读框6（E4orf6）是指人血清型腺病毒Ad5的基因组中第33193-34077位的碱基序列。

进一步地，上述基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体的构建方法包括：