[发明专利]一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种基于腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体，其特征在于，其是以人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组为基础，通过直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-CeuI和PI-SceI酶切位点，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4编码区的开放阅读框6替换HAd49的基因组的相应阅读框，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体；其中，所述人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组的GenBank登录号为DQ393829.1，人血清型腺病毒Ad5的基因组的GenBank登录号为AY601635.1。

2.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述的删除E1编码区是指删除人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第462-3362位的碱基序列。

3.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述的删除E3编码区是指删除人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第26655-30736位的碱基序列。

4.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述的HAd49的基因组的相应阅读框为人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组的E4编码区的开放阅读框6，具体为人稀有血清型腺病毒HAd49的基因组中第32257-33389位的碱基序列。

5.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述的人血清型腺病毒Ad5的E4编码区的开放阅读框6是指人血清型腺病毒Ad5的基因组中第33193-34077位的碱基序列。

6.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述重组腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

7.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述重组腺病毒表达载体的酶切位点I-CeuI和PI-SceI之间，还包括外源的抗原编码基因。

8.如权利要求7所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述外源的抗原是寨卡病毒病毒的包膜蛋白prM-E抗原。

9.如权利要求1所述的腺病毒HAd49的重组腺病毒表达载体的构建方法，其特征在于，其包括：

（1）PCR扩增HAd49的基因组的LITR片段，以pUC57-linker质粒为模板，PCR扩增Linker序列；

（2）以LITR和Linker为模板，OverlappingPCR扩增获得序列LITR-Linker，用PmeI和SpeI分别双酶切目的基因和载体，将酶切之后的目的片段插入到质粒pNEB193上，获得质粒pNEB193-LITR+linker；

（3）PCR扩增HAd49的基因组的位30736至32257片段为3；PCR扩增Ad5的基因组的E4orf6的片段为4；PCR扩增Ad49的基因组的位33389至35215片段为5；以DNA片段3,4和5为模板，OverlappingPCR扩增获得片段345，用SwaI和PacI分别双酶切目的基因和载体，将酶切之后的目的片段插入到质粒pNEB193-LITR+linker上，获得质粒pNEB193-LITR+linker+345;

(4) PCR扩增HAd49基因组的3363至15439位的DNA片段为1，通过SpeI和SrfI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+linker+345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+1345；

(5) PCR扩增HAd49的基因组的位15439至26665片段为2，通过SrfI和SwaI酶切位点，连接于质粒pNEB193-LITR+linker+1345，获得质粒pNEB193-LITR+linker+12345，即为重组腺病毒表达载体。

10.一种制备疫苗的方法，所述方法包括：

（1）提供权利要求1所述的重组腺病毒表达载体；

（2）将外源的抗原编码基因插入到（1）中重组腺病毒表达载体的酶切位点I-CeuI和PI-SceI之间；

（3）将步骤（2）的重组表达载体转染包装病毒细胞，病毒在细胞内包装完成，从而获得具有免疫原性的疫苗。