[发明专利]基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒、小反刍兽疫疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒、小反刍兽疫疫苗及其制备方法和应用。本发明将小反刍兽疫病毒血凝素蛋白与自组装铁蛋白纳米颗粒亚基N端融合得到融合蛋白。进一步将小反刍兽疫病毒血凝素蛋白跨膜区去掉后进行单位点或多位点突变，突变体的可溶性表达量和表达效率提升显著。本发明利用原核表达系统、家蚕及AcMNPV‑昆虫细胞真核表达系统表达重组蛋白或通过重组杆状病毒在脊椎动物体内进行基因呈递产生抗原诱导抗体产生。本发明所提供疫苗通过在幽门螺杆菌铁蛋白笼形结构表面展示小反刍兽疫病毒血凝素蛋白结构，引起中和性抗小反刍兽疫病毒抗体，不仅增加免疫效力还增加了免疫范围，能免疫不同年份不同遗传支系的小反刍兽疫病毒。

技术领域

本发明涉及基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒，尤其涉及包含由小反刍兽疫病毒血凝素蛋白和单体铁蛋白亚基融合在一起的纳米抗原颗粒以及由该纳米颗粒抗原制备的小反刍兽疫疫苗，属于小反刍兽疫疫苗领域。

背景技术

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Pest des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性、高传染性、高致病性疾病，主要危害山羊、绵羊等小反刍动物，中国农业部将其列为一类传染病。从系统进化来说，PPRV可分为4个谱系，属于谱系Ⅰ和Ⅱ的PPRV只在PPRV起源的西非国家中能够分离出，尽管一些谱系Ⅲ的病毒在印度南部也曾分离出，但谱系Ⅲ仅存在于阿拉伯和非洲东部国家。谱系Ⅳ则认为是由新出现的病毒毒株组成的一个新的谱系。防治PPRV的最好的工具主要是疫苗，目前应用最多的是减毒活疫苗，主要机理是诱导机理产生针对小反刍兽疫病毒表面抗原血凝素(hemagglutin，HA)的保护性抗体，其主要缺陷在于不能区分野毒感染动物和疫苗免疫动物，而高效的基因工程疫苗可以弥补这一缺陷，小反刍兽疫病毒血凝素蛋白(hemagglutin，HA)作为其主要抗原蛋白，一直是小反刍兽疫基因工程疫苗研究的热点。针对疾病最好的治疗方案莫过于防患未然，而针对各种疾病的疫苗正式发挥预防作用的主力军。因此，生产安全、高效及廉价的基因工程疫苗成为新的需求，而由24个亚基自组装而成的铁蛋白纳米颗粒正式成为一个理想的抗原呈递和疫苗开发平台。

铁蛋白主要由一个矿物质内核和一个蛋白质外壳组成，蛋白外壳由24个铁蛋白亚基自组装而成，其中每3个亚基组成一个三聚体亚单位，8个三聚体再组成一个外径12nm，内径8nm的球形空心纳米笼状结构，矿物质内核处于纳米笼状结构之中，铁蛋白非常稳定，能够耐受高温和多种变性剂而不影响其天然蛋白结构，在pH2.0的酸性条件下蛋白质发生解体，而当pH恢复到生理条件(pH7.0)时，解体的蛋白亚基又能重新组装成完整的铁蛋白，而基于其耐高温的特性使其可以通过改变溶液的pH使其解聚和重组装向铁蛋白腔内装载药物或纳米颗粒。铁蛋白由于其可以通过化学方法和基因融合进行修饰的特性使其成为理想的多功能纳米载体，其高度有序重复抗原在微生物体表面以5-10nm间隔分布时易于诱导产生强烈的T细胞依赖的抗体反应。近年来对铁蛋白的研究主要集中在：(1)通过对铁蛋白内表面的修饰使铁蛋白壳内包裹上特定药物或者促进纳米材料的合成；(2)通过对铁蛋白外表面的修饰与PEG或抗体连接以扩展新的功能；(3)通过铁蛋白外表面或亚基间接触面的修饰控制铁蛋白的自组装。铁蛋白纳米颗粒展示抗原，能够显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，因此铁蛋白是理想的纳米疫苗平台。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒；

本发明的目的之二是将所述融合蛋白去掉跨膜区并且进行突变进而提高融合蛋白的表达量或表达效率；

本发明的目的之三是提供基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒得到的纳米颗粒小反刍兽疫疫苗；

本发明目的之四提供高效表达所述融合蛋白的方法；

本发明目的之五是提供一种将自组装铁蛋白纳米颗粒与血凝素蛋白所构建的融合基因呈递给动物体内并在动物体内呈递抗原诱导产生抗体的方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：