[发明专利]一种提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1及其克隆方法与应用

说明书

本发明公开了一种提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1及其克隆方法与应用。所述的能提高烟草茉莉酸含量的NtAOS1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；采用核酸干扰（RNAi）技术，设计了1段干扰片段，采用gateway技术构建了植物表达载体并转化烟草，采用qPCR技术挑选NtAOS1基因转录水平显著降低转基因植株。茉莉酸含量检测表明：NtAOS1基因表达水平降低反而造成其茉莉酸含量显著高于野生型对照。本发明为NtAOS1基因及其编码蛋白应用于烟草抗逆育种与后续烟草中茉莉酸合成代谢途径的研究提供了材料基础。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1及其克隆方法与应用。

背景技术

茉莉酸 (jasmonic acid, JA) 及其甲酯衍生物茉莉酸甲酯 (methyljasmonate, MeJA) 是植物重要的生长调节剂，在植物生长过程中起到调控作用。一方面茉莉酸可以调节植物的生长发育，如种子的萌发与生长、器官的生长发育及植物的衰老与凋亡等，另外一方面茉莉酸还参与植物的生物胁迫和非生物胁迫的防御反应。JA 的生物合成途径也称为类十八烷生物合成途径：亚麻酸经脂氧合(lipoxygenase,LOX) 催化合成13(S)- 氢过氧化亚麻酸(13-hydroperoxylinolenic，13-HPOT)，13-HPOT 在丙二烯氧化物合成酶 (AOS)、丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase，AOC)等酶类的催化下生成10，11-二氢-12-氧植物二烯酸 (12-oxo-phytodienoic acid,OPDA)。OPDA 再经过三次β 氧化后生成JA，因此，AOS 是植物体内茉莉酸合成途径的关键酶。AOS 属于P450 超基因家族中的一员，普遍存在于植物组织中，通过调控JA 的生物合成而参与调节植物的许多生理过程。在水稻中的研究表明水稻虫害能够诱导AOS 基因的表达，而水稻中AOS2 基因的过量表达能够提高水稻内源JA 含量，诱导病程相关PR 基因表达及增强对稻瘟病的抗性；伤害胁迫能够诱导番茄叶片中AOS 基因的表达。因此AOS基因表达对提高植物对物理环境的适应和种间竞争力，增强植物防御反应具有重要作用。

JA合成途径所涉及的上游几个基因都定位于叶绿体中，而β-氧化酶定位于过氧化物酶体(peroxisome)，修饰茉莉酸的酶则存在于细胞质内。也有报道称拟南芥中与发育相关的JAs合成和与伤诱导相关的JAs合成是相互重叠的,但不完全相同，即植物中可能存在2条JA合成途径或者2种不同的合成调控通路，这给JA合成途径的研究带来了不小的难度，但同时也预示着存在更多对该合成途径进行调控的方式。

烟草中的茉莉酸合成代谢研究较少，本发明通过核酸干扰烟草NtAOS1基因，发现其烟叶茉莉酸浓度相对于野生型的烟草反而升高，通过RNAi干扰产生的转基因植株为研究烟草中的茉莉酸的合成代谢具有重大的应用价值。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1；第二目的在于提供所述的提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1的克隆方法；第三目的在于提供所述的提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的提高烟草叶片茉莉酸含量的基因NtAOS1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、根据NtAOS1基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；