[发明专利]特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列及其应用

说明书

特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。本发明通过适配体筛选技术获得的四条与链霉素具有高亲和力的单链ssDNA适配体序列Ap1，Ap2，Ap3，Ap4，且利用最优适配体Ap2建立了一种基于两轮核酸外切酶III酶切循环放大和DNAzyme催化显色反应的链霉素可视化高灵敏检测方法。本发明为链霉素残留的检测提供了亲和力高、特异性高、易修饰和标记的识别元件和新型的高灵敏检测方法。

技术领域

本发明涉及一组特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。

背景技术

链霉素是从链霉菌中通过纯化得到的氨基糖苷类抗生素。氨基糖苷类抗生素是以氨基环醇和氨基糖通过配糖键（氧桥）相连接为基础的。除了链霉素，食品中典型的氨基糖苷类抗生素还有卡那霉素、新霉素、庆大霉素、妥布霉素等。链霉素是最早运用于抗菌的抗生素药物之一，链霉素硫酸盐的稳定性较高。链霉素对于大多数革兰氏阴性菌（如结核杆菌）具有比较强大的抗菌性作用，因此是一种应用广泛的抗生素。但是因为链霉素引起的不良反应较多并且其本身毒性较大，长期使用链霉素对人以及动物都会造成危害，主要有耳毒性、肾毒性等。耳毒性主要表现为平衡性降低、姿势异常等，耳毒性严重则可能导致不可恢复的失聪。肾毒性表现为肾功能降低，肾毒性会随着链霉素的减小用量而逐渐恢复。除此以外，包括链霉素在内的氨基糖苷类抗生素都有导致过敏的风险，严重者致死，用药期过长存在二重感染的风险。因而现在已经逐步减少链霉素在抗菌方面的运用。

目前抗生素残留是食品安全中面临的重大问题之一。以链霉素为例，若长期食用含有链霉素的食品，食物中的链霉素会累积在人体内从而对人体产生毒害，严重者可能会引起过敏反应，并且人体内的某些细菌会因长期接触链霉素从而产生抗药性。因此，许多国家已经确定了许多抗生素的最大残留量标准。如，欧洲委员会所确定的链霉素最大残留量标准为每千克牛奶中链霉素最大检出量为200 µg，每千克猪肾中链霉素最大检出量为1000µg，每千克猪肉中链霉素最大检出量为500 µg。因此，建立经济实用并且精确高效的链霉素检测方法对食品安全有极为重大的意义。

核酸适配体是能够特异性识别并结合靶分子的单链DNA或RNA，基于适配体的生物传感检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点，与抗生素的传统检测方法，例如微生物检测法、仪器分析法等相比具有显著的优势，因而在近年来逐步得到应用。由于已报道的链霉素ssDNA适配体过长（79 nt），不利于在粗放的条件下进行大规模的检测应用，本发明筛选获得了一组链霉素特异性的新型短链ssDNA适配体，其长度在32~44 nt，缩短的链长不仅显著降低了检测时适配体方面的成本，而且大大提高了适配体在检测体系中的稳定性。同时这组适配体的亲和力较原先报道的适配体有非常显著的提高。

在基于适配体的检测方法中，由于适配体的核酸属性，靶分子的检测往往转化为核酸的杂交和扩增放大技术。常见的核酸信号放大技术有聚合酶链式反应信号放大技术、链置换反应信号放大技术、滚环扩增反应信号放大技术、基于核酸酶的信号放大技术。基于核酸酶的信号放大技术中所用酶按照其作用位点同样也分为核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶中常用的双链核酸外切酶是核酸外切酶Ⅲ（来源于大肠杆菌）和λ核酸外切酶（来源于λ噬菌体），常用的单链核酸外切酶是核酸外切酶Ⅰ（来源于大肠杆菌）。本发明中所用的核酸酶为核酸外切酶Ⅲ。核酸外切酶Ⅲ识别双链，沿着3’端至5’端的方向逐个催化水解单个核苷酸，其最适作用底物为平末端或凹末端的双链DNA。而G-四联体是4个鸟嘌呤碱基通过 Hoogsteen 氢键的配对方式形成稳定的共平面四方形的结构。在血红素存在时会与G四联体结合形成DNA酶结构，该酶可以催化双氧水氧化2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）从而产生绿色螯合物，该螯合物在420nm处有最大的吸光值，通过吸光值来间接反映G四联体的含量。本发明在筛选得到几条较短适配体的基础上，从中挑选了性能最佳的一条用于建立一种链霉素的可视化检测方法。该方法基于链置换和核酸外切酶III的剪切作用，具有灵敏度高，易操作，实验反应迅速的特点。

发明内容