[发明专利]特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列及其应用

权利要求书

1.特异性识别链霉素的短链DNA适配体，其特征在于：具体为选自Ap1-Ap4所示ssDNA中的一种或多种，Ap1-Ap4的具体序列如下：

SEQ ID No.1:

Ap1:5’-CGGATCGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGG-3’；

SEQ ID No.2:

Ap2:5’-CGTCGACGGATCGTGTTCTGCGCAGGTCGGACG-3’；

SEQ ID No.3:

Ap3:5’-CGTCGACGGATCGTGTTCTGCGCAGGTCGACG-3’；

SEQ ID No.4:

Ap4:5’-CGTCGACGGATCGTGTTTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGTCGACG-3’。

2.如权利要求1所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体，其特征在于：能够被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。

3.如权利要求1所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体的应用，其特征在于：将其用于制备链霉素检测的组合物、试剂盒或芯片中。

4.如权利要求1所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体的应用，其特征在于：利用其建立一种基于两轮核酸外切酶III酶切循环放大和DNAzyme催化显色反应的链霉素可视化高灵敏检测的方法。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于链霉素可视化高灵敏检测的方法为：所述适配体先与辅助探针部分配对形成双链，链霉素与适配体特异性结合，将辅助探针释放，释放的辅助探针与Hp1序列部分配对形成双链，利用核酸外切酶Ⅲ识别双链并从3’端水解单链的特性，将Hp1从3’端开始部分酶解，释放出辅助探针以及Hp1的剩余部分序列；

辅助探针循环利用与其它Hp1序列结合；而Hp1的剩余部分是一段能够形成G-四联体的序列，称为Hp1-G4，此过程称为第一次信号循环放大CycleⅠ；Hp1-G4序列能进一步与Hp2序列部分配对形成双链，由核酸外切酶Ⅲ对双链部分进行酶解后释放出能循环利用的Hp1-G4和剩余的另一段能形成G四联体的单链DNA，称为Hp2-G4，此过程称为第二次信号循环放大CycleⅡ；在富含钾离子的working buffer中，Hp1-G4和Hp2-G4形成G四联体结构，在双氧水的存在下催化ABTS^2-显色，由420nm处的吸光值大小反映靶标链霉素的浓度，检测链霉素。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于链霉素可视化高灵敏检测方法的具体步骤如下：

(1)将100μmol/L特异性识别链霉素的短链DNA适配体和辅助探针分别稀释至1μmol/L，各取10μL混合，在95℃下加热5min，随后冰浴10min，再放置至室温；之后加入5μL的不同浓度的的靶标链霉素溶液，在37℃孵育1h，作为待测样品；

(2)将各为100μmol/L的Hp1、Hp2在95℃下加热5min，随后在37℃孵育2h；将孵育后的Hp1、Hp2序列分别稀释至1μmol/L和1.25μmol/L，各取10μL加入到步骤(1)的反应体系中；接着，在冰上向样品中加入2μL的200U ExoⅢ、6μL酶缓冲液以及2μL dd H₂O，随后在37℃反应2h；反应结束后，在70℃下20min灭活ExoⅢ，至此酶辅助两轮信号放大反应完成；

(3)向步骤(2)的溶液中加入10μL 20μmol/L的血红素以及400μL的working buffer，在37℃下反应1h；随后，加入20μL 50mmol/L的ABTS和10μL 99mmol/L的H₂O₂，反应10min后，在420nm处测得样品吸光值；以吸光值对链霉素浓度作图，得到标准曲线；

(4)未知浓度的链霉素样品按步骤(1)～(3)操作，所得吸光值代入标准曲线，计算出样品中链霉素的浓度。