[发明专利]以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法

说明书

本发明公开了一种以苯丙氨酰‑tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法。所述方法通过将红球菌中苯丙氨酰‑tRNA合成酶α‑亚基关键位点的丙氨酸位点突变为甘氨酸形成苯丙氨酰‑tRNA合成酶基因突变体，苯丙氨酰‑tRNA合成酶突变体合成的tRNA可以将对氯苯丙氨酸组装进蛋白质，从而使蛋白质失去活性，导致菌体死亡，达到筛选的目的。以苯丙氨酰‑tRNA合成酶基因突变体作为红球菌基因编辑中的反向筛选标记可实现对编辑成功的菌株进行高效筛选。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，涉及一种以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法。

背景技术

红球菌隶属放线菌纲、放线菌目、诺卡式菌科、红球菌属，广泛分布在土壤、岩石、地下水、海底沉积物、昆虫内脏及动物粪便中。红球菌属菌株可以利用并降解多种形式的碳源，如糖类、烷烃类、多酚类物质，尤其对一些难降解的杂环类化合物具有较强的降解效果，例如农药、石油中复杂烷烃类物质及木质素。此外，由于红球菌中有许多特殊的酶及代谢途径，可以合成许多有价值的工业产品，例如丙烯酰胺及其他酰胺类化合物、生物表面活性剂和生物絮凝剂等（华苟根, 郭坚华. 红球菌属的分类及应用研究进展[D].2003；Kim D,Choi K Y, Yoo M, et al. Biotechnological potential of Rhodococcusbiodegradative pathways[J]. Journal of microbiology and biotechnology, 2018,28(7): 1037-1051.）。红球菌可以利用木质素及木质素衍生物生产微生物油脂等一系列化学品，也可以利用糖类、烷烃类、多酚类等物质为原料炼制许多高附加值的化学品，以及应用于环境修复与保护等领域。

目前红球菌的应用及研究大部分停留在筛选一些性能特殊或活性高的菌株，使用野生菌株进行相关生产活动。例如，张玉秀等筛选获得了一株能够降解苯酚的红球菌并将其应用到焦化废水的处理中（张玉秀, 蒙小俊, 柴团耀. 苯酚降解菌红球菌Rhodococcussp. P1 的鉴定及其在焦化废水中的应用[J]. 微生物学报, 2013, 53(10): 1117-1124.）；田雅洁等使用玫瑰红红球菌进行了废水中铵态氮的去除（田雅洁, 曹煜成, 胡晓娟, 等. 4 种因子对玫瑰红红球菌 XH2 氨氮去除效果的影响[J]. 渔业科学进展, 2018(2018 年 06): 164-172.）。随着技术的进步，基于基因编辑技术的基因工程方法已广泛应用在生物技术的许多领域。但相对于其它微生物，如大肠杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌等，红球菌缺少足够的基因编辑方法来满足其代谢工程改造的需要。

有效基因编辑方法的缺乏严重限制了红球菌的应用，目前仅有的少数针对红球菌的基因编辑通常是采用假阳性较高的筛选标记或仅采用一种抗生素作为筛选标记。使用假阳性较高的筛选标记增加了后期目标菌株筛选的工作量，而仅采用一种抗生素筛选标记则会造成基因编辑过程中抗性标记残留在细胞内，很难做到无痕编辑。例如，Hernández等人在之前的研究中仅采用一种抗生素标记对Rhodococcus opacus PD630中的atf2基因进行阻断，最后虽然达到了阻断效果，但残留了外源核苷酸片段在细胞内。外源核苷酸片段的残留不仅可能会影响细胞的性状，而且抗生素标记的残留还可能造成抗生素抗性基因的泄露，造成一定的生物安全（The atf2 gene is involved in triacylglycerolbiosynthesis and accumulation in the oleaginous Rhodococcus opacus PD630[J].Applied microbiology and biotechnology, 2013, 97(5): 2119-2130.）。

发明内容