[发明专利]以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法

权利要求书

1.以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法，其特征在于，苯丙氨酰-tRN合成酶基因突变体为苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中的α-亚基关键丙氨酸突变为甘氨酸形成的突变体，红球菌属菌株为Rhodococcus opacus，红球菌苯丙氨酰-tRNA合成酶的NCBI序列号为：Genbank：AHK32253.1，关键突变位点为A329G。

2.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，所述的基因编辑方法为基因的敲除、插入或替换。

3.根据权利要求1或2所述的基因编辑方法，其特征在于，利用传统同源重组打靶技术，以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法，包括以下步骤：

步骤1，将含有自身启动子序列的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因和自杀型质粒连接，获得骨架质粒；

步骤2，通过定点突变技术，将骨架质粒中的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中的α-亚基关键丙氨酸突变为甘氨酸形成苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体，转入到大肠杆菌DH5α中，获得自杀质粒载体；

步骤3，将靶基因位点两端同源臂拼接后插入到自杀质粒载体上，获得含有同源臂的自杀型质粒，最后将含有同源臂的自杀型质粒转化到红球菌中，获得敲除靶基因的红球菌；或将靶基因位点两端同源臂和目标基因片段拼接后插入到自杀质粒载体上，获得含有同源臂和目标基因的自杀型质粒，最后将含有同源臂和目标基因的自杀型质粒转化到红球菌中，获得目标基因插入或替换的红球菌。

4.根据权利要求3所述的基因编辑方法，其特征在于，步骤1中，所述的自杀型质粒为pk18mob质粒或pk19mob质粒。

5.根据权利要求3所述的基因编辑方法，其特征在于，步骤3中，将含有同源臂的或含有同源臂和目标基因的自杀型质粒转化到红球菌后，先通过抗生素筛选标记，获得阳性转化子，再通过对氯苯丙氨酸筛选标记，获得基因编辑成功的菌落。

6.根据权利要求3所述的基因编辑方法，其特征在于，步骤3中，所述的靶基因位点两端同源臂为靶基因位点两侧大小为200-1500 bp的核苷酸片段。