[发明专利]一种甘松愈伤组织细胞的培养方法

说明书

本发明属于组培领域，具体涉及一种甘松愈伤组织细胞的培养方法，包括以下步骤：A、取野生甘松的叶柄和叶片冲洗消毒，得到基部组织；B、将步骤A制得的基部组织切割后接种于愈伤组织诱导培养基中进行培养，得到愈伤组织；C、将步骤B制得的愈伤组织接种到愈伤组织继代培养基中进行继代培养，得到继代愈伤组织细胞；本发明使用的匙叶甘松植物叶片及叶柄诱导其愈伤组织细胞，并且在低温刺激诱导下，获得了次级代谢产物（绿原酸、多酚）含量高愈伤组织细胞；该方法能在短时间内大量获得含有活性物的甘松胚性愈伤组织细胞，具有安全无毒，周期短，繁殖快，操作简单及成本低的特点，为甘松提取物在实际产品中的应用提供了便利。

技术领域

本发明属于组培领域，具体涉及一种甘松愈伤组织细胞的培养方法。

背景技术

植物细胞组织培养（plant cell and tissue culture）是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下，使其经历脱分化、愈伤组织形成、再分化等过程一种技术。利用植物细胞组织培养方法，可以在可控的和重复的条件下从培养的植物细胞或愈伤组织中提取大量的次生代谢物质，可以为人类提供酶制剂、医药制品、添加剂。利用植物细胞大规模培养技术的方法生产植物次生代谢物得到了广泛的应用，一方面是由于其可以克服由于地理环境、气候、土壤等生长条件不同，以及采收药材时间不同，造成的植物化学成分组成及含量上差异大而直接影响药材质量的缺点；另一方面可以保护珍稀野生植物资源免遭破坏，促进资源的合理利用和可持续发展。

甘松（Nardostachys jatamansi DC.）是败酱科（Valerianaceae）甘松属（Nardostachys）多年生草本植物，生长在海拔2500-5000米的高山草地、灌丛或石砾地上，分布于甘肃，青海，四川，西藏以及云南等地区，印度、尼泊尔、不丹也有分布，是喜马拉雅典型植物。甘松不仅是西藏著名的香料植物，也是中药、藏药和印度草药的重要的药源植物。以其根及根茎入药，其性温，味辛、甘，其化学成分有萜类、黄酮类、多糖类、多酚类、木质素以及挥发油等，具有理气止痛、开郁醒脾的功能，用于脘腹胀痛、呕吐、食欲不振的治疗，外治牙痛、脚痛。国内外研究报道甘松具有降压、镇静、抗抑郁、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗心血管损伤及对人神经母细胞瘤细胞损伤的保护等作用。甘松属植物主要用根茎或种子繁殖，大多为野生，印度和中国偶有栽培。甘松由于具有很大的药用价值及芳香价值，人们过度开发使其资源受到了严重的破坏，已被列入世界濒危植物名录。

目前国内外对甘松的化学成分、药理作用及质量标准等研究比较多，但暂未看到有关甘松植物组织培养的研究报道。2017年四川省甘孜州林科所“中藏药-甘松”项目报道称,该项目基于四川农业大学分子实验室，经过多次实验探索，初步建成甘松组织培养无菌体系。

该甘松组织培养无菌体系建立的重点在于甘松外植体部位的选定。前期实验分别选用了甘松的根（根芽、根芽茎、根茎），茎（茎基、茎段）及芽进行组织培养，结果表明甘松茎基的萌发率最高，因此选用甘松茎基作为外植体。将外植体切段放入45℃温水吐温10分钟，再用流水冲洗1小时。然后将冲洗好的外植体置于超净台上用无菌水冲洗1次，再用75%酒精浸泡15秒，之后用0.1%升汞溶液浸泡8—10分钟。接着用无菌水冲洗1次后接种到空白MS培养基中进行培养。但由于匙叶甘松为国际濒危植物，该项目仅使用甘松根茎、芽为外植体，不仅容易伤害到甘松植物，而且消毒灭菌步骤繁杂，且至今未有报道成功培养出甘松整株无菌苗。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种甘松愈伤组织细胞的培养方法，并对培养得到的具有活性物的甘松胚性愈伤组织细胞进行提取及活性物质多酚和绿原酸测定。

一种甘松愈伤组织细胞的培养方法，包括以下步骤：

A、取野生甘松的叶柄和叶片冲洗消毒，得到基部组织；

B、将步骤A制得的基部组织切割后接种于愈伤组织诱导培养基中进行培养，得到愈伤组织；

C、将步骤B制得的愈伤组织接种到愈伤组织继代培养基中进行继代培养，得到继代愈伤组织细胞。