[发明专利]人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的制备方法

说明书

本发明提供一种人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的制备方法，包括：A、构建表达人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的工程菌；B、诱导表达及目的蛋白纯化；其中，所述工程菌是将重组蛋白的编码基因经密码子优化后构建到pET28a质粒上，转入大肠杆菌得到的。利用本发明提供的人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的优化基因能够获得高效表达，目的蛋白的表达水平占全菌蛋白的20％。在蛋白纯化过程中，包涵体采用十二烷基肌氨酸钠溶解，结合柱上复性，有效避免了工艺复杂，减少了变性剂尿素或盐酸胍的使用，减少了废液排放，本方法具有成本低、复性率高以及操作方便等诸多优点，为人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的制备提供了新思路。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的制备方法。

背景技术

在妇科肿瘤疾病中，宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，位居第二位。全世界每年约有20万妇女死于这种疾病。近年来的统计表明，我国每年新增宫颈癌病人在13.15万左右，占世界宫颈癌新发病例总数的28％，全世界每年约有29万女性死于宫颈癌，其中我国约为5万人，年轻宫颈癌患者的上升趋势明显。据报道，宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(HPV)感染有密切的关系，某些高危HPV病毒感染很有可能最终导致宫颈癌变。

目前的HPV疫苗可以预防HPV-16和HPV-18感染，但对于已感染人群无效。为达到治愈目的，最理想的治疗是激活人体免疫系统，彻底清除受感染的细胞。由于E6和E7是恶性肿瘤发生和维持必需的，且在正常细胞中不存在，因此，在病人体内，E6和E7蛋白是治疗性疫苗的理想靶抗原。为了加强免疫原对机体的刺激，研究人员通过定点突变技术对E6和E7基因进行了改造，去除其结合抑癌基因的作用，促使其失去转化活性和毒性，同时保留抗原性，变成非致癌形式的HPV16E6和E7蛋白，增加了疫苗安全性。

同时，为了增强免疫能力和抗肿瘤功能，与热休克蛋白(HSP)作为融合蛋白同表达，注入机体后，可以活化专职抗原递呈细胞(APC)，有效激活其免疫反应，从而激发靶向细胞介导的免疫应答和诱导机体产生抗肿瘤活性。

目前，从大肠杆菌(E.coli)中表达和纯化HPV E6是很困难的(Two-stepchromatographic purification of glutathione S-transferase-tagged humanpapillomavirus type 16E6protein and its application for serology，ProteinExpression and Purification Volume 132,April 2017,Pages 19-26)，因为它具有很强的疏水性，很容易产生蛋白聚集体，影响后续的纯化。因此，在纯化HPV E6相关重组蛋白时，国内外报道的研究资料都是采取在相关重组蛋白上设计纯化标签(如GST、MBP、HIS等)，采用亲和层析纯化才能得到高纯度目的蛋白，如大肠杆菌表达系统表达人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7HSP65融合蛋白采用HIS标签纯化，而最终目的蛋白多余的标签(冗余氨基酸)未经去除，虽然短期内看不出冗余氨基酸的副作用，但是不能保证长期使用的安全性，而且影响新药审批。

因此，亟需开发出不带标签的融合蛋白的制备工艺，同时为疫苗开发寻找一种成本低、纯度高的HPV16型E6E7HSP70融合蛋白生产新技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的制备方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的制备方法，所述方法包括：

A、表达人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的工程菌的构建；

B、诱导表达及目的蛋白纯化；

其中，所述工程菌是将人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的编码基因经密码子优化后构建到pET28a质粒上，转入大肠杆菌得到的。