[发明专利]人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的制备方法

权利要求书

1.人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

A、表达人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的工程菌的构建；

B、诱导表达及目的蛋白纯化；

其中，所述工程菌是将人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的编码基因经密码子优化后构建到pET28a质粒上，转入大肠杆菌得到的；

其中，所述人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

步骤A将人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的编码基因经密码子优化后构建到pET28a质粒的NcoI和BamHI酶切位点之间；密码子优化后的人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述大肠杆菌为BL21(DE3)、BLR(DE3)或BL21(DE3)pLysS；

步骤B包括如下子步骤：

B1、将步骤A所建工程菌接种培养，IPTG诱导表达，离心收集菌体沉淀；

B2、收集的菌体沉淀经裂解离心后，洗涤并收集包涵体，用含1-10％十二烷基肌氨酸钠或十二烷基肌氨酸的变性缓冲液重悬，离心，取上清过滤后，进行复性及后续的层析纯化；

所述变性缓冲液的组成如下：20mM Tris，10mM DTT，1mM EDTA，pH8.0；

复性所用复性液的组成如下：25mM Tris、1mM EDTA、50mM NaCl、10％甘油、3mM还原型谷胱甘肽、1mM氧化型谷胱甘肽、pH7.0；

所述层析纯化包括：依次采用丁基疏水层析柱及DEAE阴离子交换层析柱进行目的蛋白的纯化；

步骤B2包括：

1)将收集的菌体沉淀按照1g:10mL的比例，溶解在裂解缓冲液中，于均质机中700Bar压力下，4℃低温处理，破菌1-3遍，离心收集沉淀；

2)将步骤1)收集的沉淀重悬于裂解缓冲液中，在冰浴中超声处理，200W，12秒，每次间隔30秒，共超声12次；离心收集沉淀；

3)将步骤2)收集的沉淀重悬于洗涤缓冲液中，在冰浴中超声处理，200W，12秒，每次间隔30秒，共超声12次；离心收集沉淀；

4)将步骤3)收集的沉淀按照1g:5mL的比例重悬于所述含1-10％十二烷基肌氨酸钠或十二烷基肌氨酸的变性缓冲液中，在冰浴中超声处理，200W，12秒，每次间隔30秒，共超声12次；完全溶解后，离心，取上清，经0.45μm滤膜过滤后，所得滤液用于层析纯化；

5)步骤4)所得滤液以20％的柱体积上样量加至G25脱盐纯化柱，以复性液作为流动相，流速控制在2小时冲洗一个柱体积，收集蛋白峰样品；

6)将步骤5)收集的蛋白峰样品用含1.0M硫酸铵的25mM Tris，pH 8缓冲液稀释2倍；将稀释后的样品加至用含0.5M硫酸铵的25mM Tris，pH 8缓冲液预平衡的丁基疏水层析柱上，然后用3倍柱体积的含0.5M硫酸铵的25mM Tris，pH 8缓冲液洗涤，接着用10个柱体积含不同浓度硫酸铵的25mM Tris，pH 8缓冲液进行线性梯度洗脱，其中，硫酸铵的浓度由0.5M线性过度到0M；收集蛋白峰样品；

7)将步骤6)收集的蛋白峰样品用25mM Tris，pH 8平衡液稀释，以控制样品电导低于20ms/mL为准，将稀释后的样品加至用25mM Tris，pH 8平衡液预平衡的DEAE阴离子交换层析柱上，然后用10个柱体积的含不同浓度氯化钠的25mM Tris，pH 8缓冲液进行线性梯度洗脱，其中，氯化钠的浓度由1M线性过度到0M；收集目的蛋白洗脱峰样品，即为纯化的人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白；

其中，步骤1)和2)中所用裂解缓冲液的组成如下：20mM Tris，1mM EDTA，1mM PMSF，pH8.0；

步骤3)中所用洗涤缓冲液的组成如下：20mMTris，1％TritonX-100，2M尿素，pH8.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所用丁基疏水层析柱为ToyoScreenButyl-650M，所用DEAE阴离子交换层析柱为ToyoScreen DEAE-650M。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)～4)中离心条件为：4℃，12000rmp离心20分钟。