[发明专利]一种制备林蛙卵中多肽成分的方法

说明书

本发明提供一种制备林蛙卵中多肽成分的方法，该方法包括如下步骤：将新鲜林蛙卵干燥粉粹，加入水进行超声提取，用NaOH溶液调节pH，加蛋白酶进行酶解，升温灭酶，离心得水解液，干燥得林蛙卵粗多肽；以蒸馏水复溶，制备多肽溶液，上样二级大孔树脂，再用乙醇进行洗脱，回收洗脱液，旋蒸并干燥后得到林蛙卵多肽。

技术领域

本发明涉及一种超声波辅助-多级大孔树脂联用制备林蛙卵中多肽成分的方法。

背景技术

林蛙是两栖纲(Amphibia)无尾目(Anura)蛙科(Ranidae)林蛙属(Rana)动物，又称为蛤士蟆、雪蛤等。雌蛙取林蛙油后残留大量的林蛙卵，是林蛙油生产的主要副产品之一，年产量约为林蛙油的10倍。林蛙卵中含有多不饱和脂肪酸、微量元素、雌二醇、孕酮、睾酮、卵泡激素、垂体泌乳素、蛋白质、维生素、磷脂酰胆碱、鞘磷脂和林芝酰乙醇胺等多种化合物，且其活性物质丰富，证明其存在药用和保健品开发的价值。研究表明，林蛙卵对神经系统、心血管系统、内分泌系统均具有积极的改善作用，并且也具有抗氧化、抗肿瘤和抗衰老等作用。

生物活性肽由2-20个氨基酸构成，分子质量小于6000Da，一般从动植物蛋白中获得。其生物活性主要由氨基酸的组成和顺序决定，主要包括抗氧化、降血压、抗血栓、减脂、抑菌和抗炎等功效。目前，既能通过发酵、酶解等方法把蛋白质水解到一定的程度，使水解液中含有一定量的生物活性肽，也可以采取化学合成、酶法合成和DNA重组技术等定向合成法合成已知氨基酸序列的生物活性肽。然后通过超滤、凝胶色谱、离子交换色谱和高效逆流色谱等定向分离纯化技术分别依据分子质量、带电性和亲疏水性进行生物活性肽的粗分离和精分离，各方法均有其不同的优点和局限性。

CN105296585A公开了一种林蛙卵多肽及其制备方法，包括如下步骤：1)粉碎筛分，将13g脱脂干燥林蛙卵用手提式高速中药粉碎机粉碎，过60目筛；2)酶解，将步骤1)中制备的林蛙卵粉末加蒸馏水稀释2.5倍，加热至25℃并保持恒温，用lmol/LNaOH溶液或lmol/LHCl溶液调节体系pH值为6，按照酶活添加量10400u/g料加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，胰蛋白酶：木瓜蛋白酶的酶活比为1.13，底物浓度10％，酶解温度45℃，pH7.70，反应时间为3.5h；3)灭酶，反应至3.5h后，用lmol/LNaOH溶液或lmol/LHCl溶液调节pH值为7.0，水浴终止反应，水浴温度为85℃，水浴时间8min；4)两次离心，合并上清液，离心温度4℃、转速为8000r/min，时间为15min，首次离心后用蒸馏水洗涤沉淀进行二次离心；5)将上清液冷冻干燥，制得林蛙卵多肽冻干粉，研磨为均匀粉末，制得所述林蛙卵多肽。

发明内容

本发明的目的是采用一种超声辅助-多级大孔树脂联用的方法从林蛙卵中制备多肽成分。本工艺利用超声辅助加速林蛙卵有效组分提取，并显著提高产品提取率，同时利用大孔树脂进行纯化，能够放大实验，有利于大批量生产及实现工业化生产。

本发明采用的技术方案是：

一种制备林蛙卵中多肽成分的方法，该方法包括如下步骤：将新鲜林蛙卵干燥粉粹，加入水进行超声提取，用NaOH溶液调节pH，加蛋白酶进行酶解，升温灭酶，离心得水解液，干燥得林蛙卵粗多肽；以蒸馏水复溶，制备多肽溶液，上样二级大孔树脂，再用乙醇进行洗脱，回收洗脱液，旋蒸并干燥后得到林蛙卵多肽。

在本发明一些实施方式中，所述林蛙卵与水的料液比为1:2～1:15，优选为1:4-1:10。

在本发明一些实施方式中，所述的超声温度为30～70℃，优选为40-60℃。

在本发明一些实施方式中，超声提取时间为10～120min，优选为20～60min。

在本发明一些实施方式中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或者两种以上。