[发明专利]一种肿瘤来源外泌体及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种肿瘤来源外泌体及其制备方法和用途，该外泌体通过对正常分泌的外泌体进行灭活处理得到，所述灭活处理包括水浴加热处理或化学试剂处理，所述肿瘤来源外泌体能够直接作为DC细胞处理的肿瘤抗原，抑制肿瘤的生长。所述外泌体的制备方法，操作简单，易于实现，成本低廉。本发明还公开了一种用于预防接种的药物组合物及其制备方法，所述药物组合物包括DC细胞和灭活处理的肿瘤来源外泌体，通过将DC细胞和外泌体共培养得到。本发明所提供的用于预防接种的药物组合物，可显著增加瘤内浸润淋巴细胞的含量，尤其是杀伤性淋巴细胞的含量。

技术领域

本发明涉及免疫治疗技术领域，具体涉及采用外泌体进行免疫治疗，尤其涉及一种肿瘤来源外泌体及其制备方法和用途。

背景技术

外泌体(Exosome)是由细胞膜内陷后通过一系列复杂的机制形成多囊泡小体，然后多囊泡小体与细胞膜融合释放至细胞外得到的，大小为30～100nm。外泌体内含蛋白质、核酸以及脂类物质，其可以作为上述物质的运输及存储工具。外泌体存在于血液、尿液、唾液等多种体液中，在被靶细胞内吞后，内容物通过多种机制发挥功能。

肿瘤细胞能够分泌大量的外泌体(称为肿瘤外泌体)，其所包含的肿瘤特异性抗原既可作为肿瘤诊断标志物进行早期临床诊断，还可用于肿瘤免疫治疗的疗效评估及预后判定，逐渐成为恶性肿瘤的诊断工具。早期研究发现，肿瘤外泌体在抗肿瘤免疫应答中具有促进作用，其可以作为一种抗原载体将肿瘤特异性抗原通过树突状细胞提呈给CD8+T细胞，从而引起肿瘤杀伤作用。相关研究表明，在小鼠体外实验中，肿瘤外泌体表面的肿瘤排斥性抗原可以促进MHCⅠ类限制性的T细胞增殖；而在小鼠体内实验中，肿瘤外泌体可以通过激活依赖T细胞的交叉保护作用来清除自体或同种异体的肿瘤。因此，肿瘤外泌体可以作为肿瘤排斥性抗原的来源用于肿瘤免疫治疗。

但是，在对恶性肿瘤晚期患者的研究中同时发现，外泌体也可能抑制肿瘤特异性的免疫应答。与肿瘤细胞产生的细胞因子类似，肿瘤外泌体能够调节肿瘤的发展、转移及血管的生成，例如：黑色素瘤外泌体可以诱导骨髓干细胞向促进肿瘤转移的表型分化，还可以通过诱导血管内皮细胞产生TNFβ，引起淋巴管内皮细胞介导的免疫耐受反应。同时，外泌体还可以把自身的瘤源性受体、蛋白质及RNA传递给受体细胞而产生有利于肿瘤生长的微环境；肿瘤外泌体表面存在免疫抑制分子，这些分子可以通过多种途径负性调节免疫应答。

树突细胞(DCs)是专职抗原提呈细胞，具有处理抗原、提呈抗原和激活初始T淋巴细胞的功能。DCs存在于外周组织中，大部分为未成熟状态，DC可以摄取抗原并将其加工为小的多肽片段，然后激活未成熟的DC变为成熟的DC。

肿瘤微环境中，肿瘤外泌体可以降低DCs的分化和成熟。在小鼠模型中，肿瘤外泌体可降低骨髓前体细胞向DC分化，更易于诱导成骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)；在小鼠体内外实验中，乳腺癌细胞产生的外泌体作用于CD11b+的骨髓前体细胞能够抑制其向DC的分化；在人的体内实验中，肿瘤外泌体可以抑制单核细胞的分化及成熟。此外，肿瘤外泌体还会降低DCs的成熟和抗原提呈功能，相关研究发现，人胰腺癌细胞分泌的外泌体中的miR-212-3P可以引起MHC II的表达，诱导DCs的免疫耐受从而产生免疫抑制效应。也就是说，肿瘤外泌体可以通过调节DCs的分化、成熟和抗原提呈功能而产生免疫抑制效应，也就极大地限制了将肿瘤外泌体直接作为肿瘤抗原的应用。

因此，有必要提供一种外泌体，其能够直接作为DC细胞的肿瘤抗原、抑制肿瘤生长。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：将正常分泌的外泌体经过水浴加热处理或化学试剂处理，可以灭活外泌体，使得其丧失本身的促转移特性，解除对DC细胞的抑制作用；将灭活的外泌体与DC细胞制备成用于预防接种的药物组合物，能够显著抑制肿瘤的生长，增加瘤内浸润淋巴细胞的含量，尤其是杀伤性淋巴细胞的含量，增加所述药物组合物的效果，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：