[发明专利]一种基于信号级联双重放大系统以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法

说明书

本发明公开了一种基于信号级联双重放大系统以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法，该检测方法主要分为以下步骤：(1)将致病菌的多/单克隆抗体偶联至磁珠表面，获得免疫磁珠；(2)将该免疫磁珠与含有食源性致病菌的样品混合，通过抗原抗体反应特异性捕获致病菌；(3)利用引发序列修饰的致病菌适配体及DNA发卡结构探针以引发杂交链式反应，获得HCR产物(带有切口的双链DNA)；(4)向HCR产物中加入拉曼信号分子和拉曼基底，进行相应的SERS测定，实现信号的级联放大及输出。本发明对保障食品安全并预防食源性疾病的发生具有重大意义，同时对于其他生物分析也展现出了巨大的应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种基于免疫HCR联合SERS以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法，属于食源性致病菌高灵敏且快速检测技术领域。

背景技术

近年来，沙门氏菌引发的食品安全问题依旧严峻。由于被沙门氏菌污染的食品并不会表现出明显的感官性状，因此很容易被人畜误食，造成食源性疾病的发生。通常，摄入量超过10⁵CFU的沙门氏菌即可使普通人感染，而对于免疫力低下或敏感人群而言，15～20CFU即可致病，因此开发出新型的检测方法以实现高灵敏地检测沙门氏菌显得至关重要。

传统的检测方法虽然被视为金标准，但却费时耗力，整个检测过程需要4～7天左右，不能满足即时且灵敏的检测目的；基于免疫学或分子生物学的检测方法如ELISA、PCR、LAMP等方法虽然在灵敏度上得到了极大改善，但却容易出现假阳性问题，因此特异性有待提高。核酸适配体是一段经体外筛选获得的寡核苷酸序列，可与靶标高亲和力强特异性结合，因而可被用于设计成适配体传感器。HCR作为一种恒温无酶的核酸扩增技术，由于具有低成本、易合成和稳定性高的优势，有望结合适配体传感器替代PCR作为信号放大的手段；另一方面，SERS具有显著的指纹识别能力和强大的信号放大能力，且无需对样品进行复杂的前处理，目前已被应用于多种分析方法中，若作为其他放大技术如HCR的信号输出方式，则有望进一步提高检测的灵敏度，同时缩短检测时长。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于免疫HCR联合SERS进行信号级联放大以高灵敏检且快速检测食源性致病菌的方法，具体技术方案如下：

一种基于信号级联双重放大系统以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法，是基于免疫杂交链式反应联合表面增强拉曼散射的信号级联双重放大系统以高灵敏快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，所述免疫杂交链式反应是免疫磁珠通过抗原抗体的特异性反应以捕获靶标菌，靶标菌再与对应的核酸适配体传感器反应延伸出HCR产物，最终体系形成了一个“免疫磁珠-靶标菌-DNA双链”的三明治夹心结构复合物。

所述表面增强拉曼散射是，所用的拉曼信号分子嵌入DNA双链中而淬灭拉曼特征谱峰信号；相反，处于游离状态的拉曼信号分子则通过静电作用与纳米银颗粒结合形成热点而生成拉曼特征谱峰，且信号强度与靶标菌的数量在一定范围内存在相关关系。

所述磁珠为表面修饰了活性基团的磁珠，所述抗体为抗靶标菌多克隆抗体或单克隆抗体。

所述抗靶标菌免疫磁珠的制备方法如下：

取适量修饰了活性基团的磁珠，加入适量缓冲液清洗几次以除去原保存液，然后加入新鲜配制的活化溶液室温振荡半小时以活化磁珠表面的活性基团；加入抗靶标菌多/单克隆抗体，室温振荡孵育一段时间，除去剩余的抗体溶液，再用PBST清洗两次，最后将获得的免疫磁珠存储于BSA封闭液中并保存备用。

所述免疫磁珠捕获靶标菌的方法如下：

取适量免疫磁珠存储液，于磁力架上除去多余的溶液，再用PBST清洗2～3次，除去多余的BSA，然后加入含有靶标菌的样品，室温孵育一定时间，最后用PBST清洗1～2次，获得免疫磁珠-靶标菌复合物。

所用DNA序列如下：