[发明专利]一种基于信号级联双重放大系统以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法

权利要求书

1.一种基于信号级联双重放大系统以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法，是基于免疫杂交链式反应联合表面增强拉曼散射的信号级联双重放大系统以高灵敏快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，(1)将致病菌的多/单克隆抗体偶联至磁珠表面，获得免疫磁珠；(2)将该免疫磁珠与含有食源性致病菌的样品混合，通过抗原抗体反应特异性捕获致病菌；(3)利用引发序列修饰的致病菌适配体及DNA发卡结构探针以引发杂交链式反应，获得HCR产物，即带有切口的双链DNA；(4)向HCR产物中加入拉曼信号分子和拉曼基底，进行相应的SERS测定，实现信号的级联放大及输出。

2.根据权利要求书1所述的检测方法，其特征在于，所述免疫杂交链式反应是免疫磁珠通过抗原抗体的特异性反应以捕获靶标菌，靶标菌再与对应的核酸适配体传感器反应延伸出HCR产物，体系形成了一个免疫磁珠-靶标菌-DNA双链的结构复合物。

3.根据权利要求书1所述的检测方法，其特征在于，所述表面增强拉曼散射是，所用的拉曼信号分子嵌入DNA双链中而淬灭拉曼特征谱峰信号；相反，处于游离状态的拉曼信号分子则通过静电作用与纳米银颗粒结合形成热点而生成拉曼特征谱峰，且信号强度与靶标菌的数量在一定范围内存在相关关系。

4.根据权利要求书1所述的检测方法，其特征在于，所述磁珠为表面修饰了活性基团的磁珠，所述抗体为抗靶标菌多克隆抗体或单克隆抗体。

5.根据权利要求书1所述的检测方法，其特征在于，抗靶标菌免疫磁珠的制备方法如下：

取适量修饰了活性基团的磁珠，加入适量缓冲液清洗几次以除去原保存液，然后加入新鲜配制的活化溶液室温振荡半小时以活化磁珠表面的活性基团；加入抗靶标菌多/单克隆抗体，室温振荡孵育一段时间，除去剩余的抗体溶液，再用PBST清洗两次，最后将获得的免疫磁珠存储于BSA封闭液中并保存备用。

6.根据权利要求书1所述的检测方法，其特征在于，免疫磁珠捕获靶标菌的方法如下：

取适量免疫磁珠存储液，于磁力架上除去多余的溶液，再用PBST清洗2～3次，除去多余的BSA，然后加入含有靶标菌的样品，室温孵育一定时间，最后用PBST清洗1～2次，获得免疫磁珠-靶标菌复合物。

7.根据权利要求书1所述的检测方法，其特征在于，所述制备HCR方法如下：

向上述免疫磁珠-靶标菌复合物中加入引发序列修饰的适配体，孵育一段时间，除去未结合的适配体后再加入发卡结构的探针H1和H2，孵育一段时间以引发杂交链式反应，除去未反应的探针后，最终获得免疫磁珠-靶标菌-适配体HCR延伸产物的复合物。

8.根据权利要求书1所述的检测方法，其特征在于，表面增强拉曼散射检测方法如下：

设置好拉曼仪的测定条件；向上述免疫磁珠-靶标菌-适配体HCR延伸产物的复合物中加入过量拉曼信号分子，混匀，避光孵育一段时间；再加入适量纳米银胶体，混匀，避光孵育一段时间；取适量体系于玻璃板上，避光条件下扣除背景后测定。