[发明专利]一种快速筛查试剂盒及引物组

说明书

本发明公开了一种快速筛查试剂盒及引物组，该试剂盒包括：(1)多重PCR反应液：含有DNA聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液；(2)引物混合液：将如下的扩增sul1、sul2、intI1、intI2和intI3的5对引物用双蒸水溶解后分组混合；(3)阳性对照液：分别含有磺胺耐药基因sul1和sul2以及整合酶基因intI1、intI2和intI3的质粒水溶液的混合物。本发明所述试剂盒具有操作简便、结果易判、成本低廉、高效灵敏等优点，可用于各种细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的全面筛查检测。

技术领域

本发明属于生命科学与生物技术领域，具体涉及细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒及引物组。

背景技术

磺胺类药物是一类广谱抑菌剂，对许多革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌、衣原体和部分原虫都有抑制效果，而且价格低廉，因此在临床上使用非常广泛。目前，细菌对磺胺类药物的耐药性已较为普遍，其中，质粒介导的磺胺耐药基因的迁移极大地推进了磺胺耐药性在细菌间的传播。目前已发现的可在细菌间迁移的磺胺耐药基因有3个，包括sul1、sul2和sul3，除sul3较为罕见外，sul1和sul2在多种细菌中都被发现。因此，对这三个基因的检测能反映细菌对磺胺类药物的耐药情况。整合子在细菌中广泛存在，其具有捕获并表达外来耐药基因盒(一个或多个耐药基因)的能力，因此，通过检测整合酶基因(intI)来确定整合子的类型是研究整合子介导的细菌耐药的传播及机理性的基础。本团队前期研究表明，同时携带磺胺耐药基因和整合酶基因的菌株更易发生磺胺耐药基因的迁移，将磺胺耐药基因扩散出去。因此，同时筛查磺胺耐药基因和整合酶基因有助于提高对细菌的磺胺耐药性迁移风险评估研究的效率。

利用普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术、多重PCR技术和基因芯片技术等，可实现耐药基因的初步排查。普通的单重PCR筛查效率低，每个反应体系只能完成一株细菌中一个耐药基因的定性分析，无法满足在大量细菌样本中进行多个基因的筛查的需求；基因芯片技术能实现耐药基因的高通量筛查，但依赖昂贵的硬件设备，试剂和耗材的成本也较高，在大多数普通实验室中无法推广应用。相较于上述两种技术，多重PCR技术是大量细菌样本中快速筛查耐药基因的理想选择。周万蓉开发了同时检测sul1、sul2和sul3基因的多重PCR试剂盒，但sul1基因的上游引物在该基因的起始密码子之前，因此无法用于检测菌株cDNA中表达的sul1基因。李心晖开发了三类整合酶基因的简并引物PCR检测法，但PCR反应后还需进行酶切鉴定以进一步区分整合酶基因的类型，因此操作步骤比较繁琐。综上，开发能同时检测常见磺胺耐药基因(sul1和sul2)和整合酶基因(intI1、intI2和intI3)的多重PCR试剂盒，对于细菌中磺胺耐药基因的迁移风险评估研究十分重要。

综上，针对细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的检测，现有的技术的缺点主要包括：

(1)开发的多重PCR体系仅针对磺胺耐药基因或整合酶基因，至少需要两个PCR体系才能完成磺胺基因和整合酶基因的检测；

(2)已开发的磺胺耐药基因的多重PCR检测体系中，因部分引物位于磺胺耐药基因起始密码子的上游，导致体系不适合对细菌样本cDNA文库中能表达成蛋白的磺胺耐药基因的检测。

发明内容

本发明的目的是通过设计高特异性、目的序列位于起始密码子之后的引物序列对，提供一种细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒，在一个五重PCR体系中，实现对细菌中2个磺胺耐药基因(sul1和sul2)和3个整合酶基因(intI1、intI2和intI3)的同时快速检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速筛查试剂盒，用于对细菌中磺胺耐药基因sul1和sul2、以及整合酶基因intI1、intI2和intI3的快速筛查，所述试剂盒包括：

(1)多重PCR反应液：含有DNA聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液；