[发明专利]一种检测miRNA的生物探针及检测方法和用途

说明书

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种检测miRNA的生物探针及检测方法和用途，包括第一拱形探针和第二拱形探针；所述第一拱形探针和第二拱形探针均为两条单链线形分子的末端碱基互补杂交而成；所述第一拱形探针包括靶miRNA结合序列区，核酸内切酶识别序列区和DNA聚合酶延伸序列区；所述第一拱形探针与靶miRNA结合后经链延伸和剪切反应释放的寡核苷酸为二级引物；所述第二拱形探针包括二级引物结合序列区，核酸内切酶识别序列区和DNA聚合酶延伸报告序列区；所述第二拱形探针与二级引物结合后经链延伸和剪切反应释放报告序列；基于所述miRNA的生物探针介导的miRNA检测方法，具有灵敏度高，特异性强，设计简单，检测快速和成本低的优势。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测miRNA的生物探针和检测miRNA的荧光生物传感器及其用途和miRNA的检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类内源性的短非编码RNA分子，长度为17-25个核苷酸，由两个RNase III酶(Drosha和Dicer)连续切割长的初级转录产物产生。miRNA具有调控功能，广泛存在于真核生物中，多数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性。到目前为止，在人类基因组中已发现超过1000种miRNAs，因其具有抑制靶mRNA转录、翻译或者能够剪切靶mRNA并促进其降解的功能，所以在人类多种生物过程中起着至关重要的作用，如细胞生长、分化、凋亡和增殖等过程。越来越多的证据表明，miRNA在人体组织或血液样本中的异常表达与各种疾病密切相关，如糖尿病、神经系统疾病，尤其是癌症。因此，准确的miRNA定量分析对于疾病的发病机制和早期诊断的临床研究具有重要意义。

鉴于miRNA定量分析的重要性，过去的几十年里已经开发了几种用于miRNA分析的常规技术，如Northern印迹、微阵列和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等，这些方法准确度高、应用广泛，但也存在一些不足包括灵敏度不足，特异性差，样品制备繁琐，检测时间长等。

近年来，发展了许多新的miRNA分析方法，如等温扩增策略应用于miRNA的微量分析，具有简单、高灵敏度和高特异性的优势，包括杂交链式反应(HCR)、指数扩增反应(EXPAR)、催化发夹组装(CHA)、链置换扩增(SDA)和滚环扩增(RCA)。在这些策略中，EXPAR由于其对短寡核苷酸的快速且有效的非线性扩增而在生物分析中受到越来越多的关注。由于使用具有链延伸特性的DNA聚合酶和具有位点特异性DNA切口活性的限制性核酸内切酶，EXPAR具有等温、快速扩增动力学和高扩增效率的内在优点。因此，EXPAR策略可以在恒温条件下几分钟内达到10⁶～10⁹倍的扩增，并且可以获得更低的检测限。如“SensitiveDetection of MicroRNA in Complex Biological Samples viaEnzymatic SignalAmplification Using DNA Polymerase Coupled withNicking Endonuclease”(Bin-Cheng Yin,Yu-Qiang Liu,and Bang-Ce Ye*，[J].AnalChem,2013,85(23)：11487-11492.)中公开的采用DNA聚合酶与Nicking核酸内切酶的信号放大反应用于miR-141的检测，最低检测限为1fm。然而，发明人发现上述文献中还存在一些不足，如其在方案1中，需要大量的分子信标和引物，提高了实验成本，实验设计较为复杂，且在两个循环过程中，仅是不断的打开分子信标，实现荧光发射，分子信标本身没有得到扩增，受到分子信标的浓度的限制，影响检测的灵敏度。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种快速、简单、低成本、高检测灵敏度和特异性的用于检测miRNA的生物探针和检测miRNA的生物传感器及其用途和miRNA的检测方法。

为此，本发明提供了以下技术方案：

一种检测miRNA的生物探针，包括第一拱形探针和第二拱形探针；所述第一拱形探针和第二拱形探针均为两条单链线形分子的末端碱基互补杂交而成；