[发明专利]一种检测miRNA的生物探针及检测方法和用途

权利要求书

1.一种检测miRNA的生物探针，其特征在于，由第一拱形探针和第二拱形探针组成；所述第一拱形探针和第二拱形探针均为两条单链线形分子的末端碱基互补杂交而成；

所述第一拱形探针包括靶miRNA结合序列区，核酸内切酶识别序列区和DNA聚合酶延伸序列区；所述第一拱形探针与靶miRNA结合后经链延伸和剪切反应释放的寡核苷酸为二级引物；所述第一拱形探针包括单链线形分子S1和S2，单链线形分子S1上沿着分子延伸方向依次包括靶miRNA结合序列区（I），核酸内切酶识别序列区（II）和DNA聚合酶延伸序列区（III）；单链线形分子S2的末端分别与靶miRNA结合序列区（I）和DNA聚合酶延伸序列区（III）部分互补杂交；

所述第二拱形探针包括二级引物结合序列区，核酸内切酶识别序列区和DNA聚合酶延伸报告序列区；所述第二拱形探针与二级引物结合后经链延伸和剪切反应释放报告序列；所述第二拱形探针包括单链线形分子S3和S4，单链线形分子S3上沿着分子延伸方向依次包括二级引物结合序列区（I’），核酸内切酶识别序列区（II’）和DNA聚合酶延伸报告序列区（III’）；单链线形分子S4的末端分别与二级引物结合序列区（I’）和DNA聚合酶延伸报告序列区（III’）部分互补杂交。

2.一种检测miRNA的生物传感器，其特征在于，包括权利要求1所述的检测miRNA的生物探针。

3.根据权利要求2所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，包括A反应试剂和B反应试剂，所述A反应试剂包括：第一拱形探针、待测miRNA和核酸内切酶缓冲液；所述B反应试剂包括：第二拱形探针、DNA聚合酶、核酸内切酶、dNTPs和RNase抑制剂。

4.根据权利要求 3所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，还包括DNA银纳米簇反应液：含有Ag离子的缓冲液和/或NaBH₄水溶液。

5.根据权利要求3或4所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，所述第一拱形探针和第二拱形探针的摩尔比为（2-3）:3。

6.根据权利要求3或4所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，所述第一拱形探针和第二拱形探针的摩尔比为2:3。

7. 根据权利要求3或4所述的检测miRNA的生物传感器，其特征在于，所述DNA聚合酶为Vent (exo-) DNA聚合酶；所述核酸内切酶为Nt.BstNBI核酸内切酶。

8.一种非疾病诊断或治疗的检测miRNA的方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的检测miRNA的生物探针和/或权利要求2-7任一项所述的检测miRNA的生物传感器进行检测。

9.根据权利要求8所述的非疾病诊断或治疗的检测miRNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

Q1、将第一拱形探针、待测miRNA和核酸内切酶缓冲液混合，孵育，然后冷却，使得靶miRNA与第一拱形探针杂交；

Q2、向Q1中获得的反应液中加入第二拱形探针、DNA聚合酶、核酸内切酶、dNTPs、RNase抑制剂和ThermoPol缓冲液，孵育；

Q3、向Q2中获得的反应液中加入含有Ag离子的缓冲液，室温离心，收集上清液，第一次室温避光孵育，然后加入NaBH₄水溶液，第二次室温避光孵育，检测。

10.根据权利要求9所述的非疾病诊断或治疗的检测miRNA的方法，其特征在于，在所述Q1步骤中，孵育时间为3-7min，孵育温度为93-97℃，然后冷却至50-60℃。

11.根据权利要求10所述的非疾病诊断或治疗的检测miRNA的方法，其特征在于，孵育时间为5min，孵育温度为95℃，然后冷却至55℃。