[发明专利]一种脂肪酶在制备D-托品酸甲酯中的应用

说明书

本发明提供了一种脂肪酶在制备D‑托品酸甲酯中的应用，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。以重组脂肪酶工程菌发酵培养获得的湿菌体经冷冻干燥后得到的冻干菌体为催化剂，外消旋托品酸甲酯为底物，以pH7.0磷酸缓冲溶液为反应介质，进行拆分制备D‑托品酸甲酯，对映体过量值99％，D‑托品酸甲酯的收率达到95.0％。

(一)技术领域

本发明属于生物酶催化领域，涉及一种脂肪酶立体选择性催化水解外消旋DL-托品酸甲酯合成单一构型的D-托品酸甲酯的应用。

(二)背景技术

托品酸(Tropic acid，TA)是一个重要的药物前体，可用作合成手性药物的原料。它常用于合成抗胆碱药物，如阿托品(也称莨菪碱)和东莨菪碱。这两种药物具有相似的治疗效果，是一类节后抗胆碱药，具有较广泛的药理作用，用于放松平滑肌，抑制唾液和汗腺的分泌以及预防晕眩病。它们是含有手性中心的化合物，其对映体通常具有极为相近的理化性质，但药理和毒理作用却存在着很大差异，往往一种立体异构体有药效而它的镜像分子的药效却很低，甚至完全没有药效或具有副作用，因此，获得用于改善功效的光学对映体是至关重要的。光学纯TA作为莨菪碱等抗胆碱药物的手性结构单元具有关键的作用，单一对映体托品酸及它们的衍生物都是重要的医药原料和医药中间体。因对映体D-托品酸具有低毒性以及很高的镇痛活性等优点，此外，D-托品酸已应用于人工环状缩酚肽的合成。所以在外消旋托品酸甲酯的手性拆分研究中，获得光学纯的D-托品酸甲酯是一些手性抗胆碱药物合成的必然要求。

目前有许多文献报道了托品酸的光学对映体的手性拆分路线，如动力学拆分、溶剂诱导手性转换、色谱技术、毛细管电泳等方法。综合以上几种拆分方法可知在这些工艺途径中均存在着收率低、成本高、步骤繁多、产物纯度较低、污染严重等问题，从而不能成功地进行工业化。酶法拆分能够利用酶的高度立体、位点、区域选择性，催化化学合成的外消旋体或衍生物中的某一对映体进行水解以获得高产率、高选择性的单一对映体，具有选择性高、反应条件温和、反应较稳定及易于工业化等特点。同时，酶法拆分可以解决现有方法易造成环境污染，产生大量无效甚至对环境有害的对映体问题，对于保护人类的自然环境和健康具有极为重要的意义。因此，我们提供了一种脂肪酶催化水解拆分制备DL-托品酸甲酯来高效生产D-托品酸甲酯的有效方法。

(三)发明内容

本发明目的是为了解决现有方法的不足，通过筛选产脂肪酶微生物，提供一种廉价高效的立体选择性脂肪酶在生物法拆分DL-托品酸甲酯制备D-托品酸甲酯中的应用。本发明利用新筛选的脂肪酶催化立体选择性水解反应拆分制备高光学纯度的D-托品酸甲酯，催化剂易得成本低，ee值和转化率高，路线短操作简便，开发成本低廉、适合产业化放大工艺路线，具有很大的社会意义和经济价值。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种脂肪酶在拆分DL-托品酸甲酯中的应用(如图2所示)，所述脂肪酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列为SEQ ID NO.2所示，具体的应用方法为：以含立体选择性脂肪酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体冷冻干燥后得到的脂肪酶粗酶粉为催化剂，以外消旋DL-托品酸甲酯为底物，以pH 7.0缓冲液为反应介质，在25-50℃、200rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得D-托品酸甲酯。所述催化剂用量以缓冲液体积计为5g/L-40g/L(优选10g/L)，所述底物体积用量以缓冲液体积计为0.5％-3％(V/V)(优选1％)。

进一步，优选反应时间为30min-120min，更优选反应条件为35℃、200rpm反应60min。

进一步，所述缓冲液为pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。