[发明专利]基于类弹性蛋白展示N-端脑钠肽前体双抗原表位的制备方法在审
| 申请号： | 201910687576.2 | 申请日： | 2019-07-29 |
| 公开（公告）号： | CN110358785A | 公开（公告）日： | 2019-10-22 |
| 发明（设计）人： | 胡学军;杨春光;付鑫 | 申请（专利权）人： | 大连大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/62 |
| 代理公司： | 大连八方知识产权代理有限公司 21226 | 代理人： | 卫茂才 |
| 地址： | 116622 辽*** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 抗原表位 重组蛋白 表位 氨基酸残基 大肠埃希菌 类弹性蛋白 脑钠肽 前体 展示 制备 类弹性蛋白标签 抗原表位基因 融合表达载体 原核表达载体 夹心ELISA法 表达系统 可逆相变 融合基因 校准品 克隆 合成 融合 检测 | ||
1.基于类弹性蛋白(elastic-like polypeptide, ELP)展示N-端脑钠肽前体(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide, NT-proBNP)双抗原表位的制备方法，可以制备用于夹心ELISA法检测NT-proBNP的校准品，其特征在于：首先将用柔链连接的NT-proBNP第13-20位氨基酸残基表位、第63-71位氨基酸残基表位与ELP用Poly N柔链连接融合，紧接着将编码以上重组蛋白基因合成并克隆到原核表达载体上，构建成NT-proBNP双抗原表位基因的融合表达载体，最后利用大肠埃希菌表达系统制备用于夹心ELISA法检测NT-proBNP的校准品。
2.如权利要求1所述的基于类弹性蛋白展示N-端脑钠肽前体双抗原表位的制备方法，其特征在于：基于人源NT-proBNP氨基酸序列（EMBL-EBI数据库：https://www.ebi.ac.uk/，登入ID: NRP000FB92A，见图1)设计的NT-proBNP抗原表位基因，分别编码NT-proBNP中 第13-20位氨基酸残基ETSGLQEQ（其中E代表谷氨酸残基，T代表苏氨酸残基，S代表丝氨酸残基，G代表甘氨酸残基，L代表亮氨酸残基，Q代表谷氨酰胺残基）；所述的NT-proBNP中第63-71位氨基酸残基GHRKMVLYT（其中G代表甘氨酸残基，H代表组氨酸残基，R代表精氨酸残基，K代表赖氨酸残基，M代表甲硫氨酸残基，V代表缬氨酸残基，L代表亮氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，T代表苏氨酸残基）。
3.如权利要求1所述的基于类弹性蛋白展示N-端脑钠肽前体双抗原表位的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将柔链（linker）连接的两个NT-proBNP抗原表位基因和类弹性蛋白ELP通过常规基因克隆方法克隆到pET28a(+)原核表达载体上，双抗原表位与ELP之间由柔链（Poly N）连接，构建为NT-proBNP双抗原表位基因融合表达载体；
（2）将上一步构建的重组蛋白表达载体通过电击转化成大肠埃希菌表达菌株，并筛选出阳性转化子；
（3）将上一步筛选出的阳性转化子进行诱导表达，再收集菌体，经过超声破碎后，利用ITC方法纯化出NT-proBNP双抗原表位融合蛋白。
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