[发明专利]基于类弹性蛋白展示N-端脑钠肽前体双抗原表位的制备方法

说明书

本发明公开一种利用大肠埃希菌制备类弹性蛋白展示N‑端脑钠肽前体双抗原表位重组蛋白的方法，其中设计了NT‑proBNP第13‑20位氨基酸残基表位和第63‑71位氨基酸残基表位，通过柔链将这两个表位连接并通过柔链与类弹性蛋白标签融合，将编码后的以上重组蛋白融合基因合成并克隆到原核表达载体上，构建成ELP展示NT‑proBNP双抗原表位基因的融合表达载体，利用大肠埃希菌表达系统表达ELP展示NT‑proBNP双抗原表位重组蛋白。本发明依据ELP多次可逆相变循环(ITC)的突出特性高效、快速、简便地纯化出NT‑proBNP双抗原表位重组蛋白，直接用于夹心ELISA法检测NT‑proBNP校准品。

技术领域

本发明属于生物标志物制备领域，具体涉及基于类弹性蛋白展示N-脑钠肽前体双抗原表位的制备方法。

背景技术

NT-proBNP作为鉴定心衰和检测心衰严重程度的标志物被广泛用于心血管疾病的诊断治疗及预后应用中。NT-proBNP作为检测抗原校准品的来源包括心衰患者血浆分离、化学合成、大肠埃希菌重组和真核细胞重组表达等。这几种来源成本较高，纯化过程复杂，或者稳定性较差。目前较好的NT-proBNP检测系统是“夹心免疫检测系统”。该系统包含捕获抗体和检测抗体，捕获抗体通过结合到NT-proBNP相对稳定的抗原决定簇而捕获抗原，检测抗体通过识别另一个抗原决定簇而检测抗原，这种检测系统稳定性更高。

所述的“抗原决定簇”（antigenic determinant）也称为抗原表位（antigenicepitope），是指抗原表面上决定抗原特异性的化学基团。研究显示，心衰患者血浆中的NT-proBNP是O-糖基化蛋白，其中心区域28-56位氨基酸残基部位被糖基化，很难被识别这个区域表位的抗体检测出来，为了确保检测人血浆中NT-proBNP的准确性，HyTest公司推荐该公司筛选出的15C4_63-71-13G12_13-20抗体组合作为捕获抗体-检测抗体，可分别与NT-proBNP分子第63-71位和13-20位氨基酸残基表位高效亲和，不受糖基化影响，适用于NT-proBNP精确检测系统。

类弹性蛋白(elastin-like polypeptide，ELP) 是一种独特的重组蛋白，一般作为分离纯化标签使用。ELP[n]的主要结构由五肽重复序列单元(VPGXG)串联组成，其中客座残基X可以是除脯氨酸以外的任一氨基酸，n代表ELP链中五肽重复次数，ELP具有温度诱导的可逆相变性质，当ELP与目的蛋白融合后，赋予重组蛋白类似的可逆相变性质。利用多次可逆相变循环(inverse transition cycling，ITC)之后，就可以从蛋白混合液中选择性地分离出ELP融合蛋白。

公告号CN 106222189 U的专利提供了一种基于类弹性蛋白标签制备重组N-端脑钠肽前体的方法，该方法通过基因重组，将N-端脑钠肽前体基因克隆到pET28a(+)/ELP[I]40 原核表达载体上，将重组表达载体转入到大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，收集菌体后，利用多次可逆相变循环ITC方法纯化重组蛋白，该蛋白即为ELP[I] 40 -NT-proBNP重组蛋白。该方法可快速、简便、高效纯化具有与抗NT-proBNP抗体结合活性的融合蛋白，为高效低成本制备具有脑钠肽前体抗原性的标准品奠定基础。为实现快速、大规模分离制备具有NT-proBNP抗原特性的重组抗原表位融合蛋白的目标可以看作起到基础性的一种引导作用。

发明内容

本发明目的是提供一种基于类弹性蛋白展示N-端脑钠肽前体双抗原表位的制备方法，实现降低生产成本，实现快速、大规模分离制备具有NT-proBNP抗原特性的重组抗原表位融合蛋白的目标。

为实现上述目的，采用的以下技术方案：