[发明专利]一种索玛鲁肽的纯化方法

说明书

本发明公开了一种索玛鲁肽的纯化方法，包括以下步骤：(1)将索玛鲁肽粗品溶于稀氨水，水浴后过滤，收集滤液；(2)以反相硅胶填料为固定相，氨水调节pH至7～9的盐溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱，收集馏分，旋蒸去除部分溶剂，得到一次纯化溶液；(3)以反相硅胶填料为固定相，磷酸调节pH至2～3的盐溶液为流动相A，乙腈和异丙醇的混合溶液为流动相B，梯度洗脱，收集馏分，旋蒸去除部分溶剂，得到二次纯化溶液；(4)以反相硅胶填料为固定相，碳酸氢铵的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱，收集馏分，旋蒸、冻干，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽。该方法操作简便，有利于实现索玛鲁肽的规模化制备。

技术领域

本领域涉及一种肽的纯化方法，特别涉及索玛鲁肽的纯化方法。

技术背景

索玛鲁肽，英文名称为Semaglutide，是由丹麦诺和诺德公司开发生产的一种新型长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，用于治疗II型糖尿病。索玛鲁肽具有降血糖、减肥和保护心血管的功效，已于2017年10月18日被FDA建议批准上市。索玛鲁肽的Lys侧链经PEG、Glu和十八碳二羧酸修饰后，亲水性大大提高、与白蛋白的结合力增强；同时N端第2位的Ala突变为Aib后，有效的避免了被DPP-IV酶解而失活，半衰期达到40h，患者每周只需注射一次，目前该药物的口服剂型也正在研制当中。索玛鲁肽的CAS号为910463-68-2，分子式为C187H291N45O59，分子量为4113.64g/mol，肽序列为：

H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-AEEA-AEEA)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

索玛鲁肽的肽链较长、支链结构复杂，在合成过程中产生的杂质多，其中索玛鲁肽中的His¹极易消旋，产生的D-His¹杂质物理和化学性质与索玛鲁肽极其相似，因此需要对索玛鲁肽粗肽进行纯化。然而现有的技术纯化效果差，并不足以将索玛鲁肽杂质控制在单杂0.1％以下，且未对此主要杂质D-His¹杂质进行针对性的控制策略。因此，需要探索一种索玛鲁肽的纯化方法，以提高索玛鲁肽的纯度，并且操作简便，有利于实现索玛鲁肽的规模化制备。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的技术不足，提供一种纯化索玛鲁肽的方法，使单杂降低到0.1％以下，同时解决索玛鲁肽D-His¹杂质纯化的问题。为了实现该目的，本发明提供的索玛鲁肽的纯化方法如下：

步骤1：将索玛鲁肽粗品溶于稀氨水中，得到索玛鲁肽粗品溶液，将粗品溶液于45～50℃水中水浴1～2h后用0.45μm过滤，收集滤液；

步骤2：取上述滤液，以反相硅胶填料为固定相，以氨水调节pH至7～9的盐溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱，收集馏分，旋蒸去除部分溶剂，得到索玛鲁肽一次纯化溶液；

步骤3：取索玛鲁肽一次纯化溶液，以反相硅胶填料为固定相，以磷酸调节pH至2～3的盐溶液为流动相A，乙腈和异丙醇的混合溶液为流动相B，梯度洗脱，收集馏分，旋蒸去除部分溶剂，得到索玛鲁肽二次纯化溶液；

步骤4：取索玛鲁肽二次纯化溶液，以反相硅胶填料为固定相，以碳酸氢铵的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱，收集馏分，旋蒸、冻干，得到索玛鲁肽的无盐精肽。

其中，反相硅胶填料优选为八烷基键合硅胶填料。

八烷基键合硅胶柱对索玛鲁肽及其杂质有较优的选择性。

优选地，步骤2、3中的旋蒸参数为：25～35℃，真空度≤30mba，步骤4中的旋蒸参数为：25～35℃，真空度≤20mba。