[发明专利]芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用

说明书

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体芽胞杆菌rex基因在提高聚γ‑谷氨酸产量中的应用。本方法采用分子生物学技术，通过在地衣芽胞杆菌中敲除转录抑制因子基因rex，获得了rex缺失的地衣芽胞杆菌工程菌株WX‑02△rex，显著提高了地衣芽胞杆菌甘油代谢的速率。WX‑02△rex在不同培养基中的甘油消耗速率比原始菌地衣芽胞杆菌WX‑02至少提高了10.55%，最高可达27.94%。利用该菌株在聚γ‑谷氨酸发酵培养基中能够显著提高聚γ‑谷氨酸的产量，至少提高了35.29%，最高可达50%。说明该基因工程改造方法在提高微生物甘油代谢速率具有重要作用，并提高甘油合成生物基化学品的效率。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用。

背景技术

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)，又称纳豆菌胶、多聚γ-谷氨酸，它是一种通过微生物发酵法制得的生物高分子聚合物，主要由L-谷氨酸和(或)D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成，分子量通常为10KD-10000KD。γ-PGA具备良好的水溶性、吸附能力、可被生物降解、对人体和环境无毒害等特性，在众多领域中具有广泛的应用价值，在医学领域中，可用作药物缓释剂；在污水处理方面，可作为吸附剂和絮凝剂；在农业领域，可作为保水剂，增肥剂，增效剂。由于γ-PGA具有良好的经济价值和广泛的应用前景，γ-PGA的生产受到愈来愈广泛的重视。

NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，主要产生于糖酵解和柠檬酸循环，用于胞内大多数氧化还原反应，是微生物生命代谢活动中必不可少的辅因子；Rex，NADH相关的转录因子，对细胞内氧化还原电位作出反应，并对参与革兰氏阳性细菌能量代谢和发酵生长的基因的表达进行负性控制；Rex的DNA结合活性受细胞内NADH/NAD+比率的调节，在较低的NADH:NAD+比值下，Rex蛋白与靶位点结合，抑制参与NADH再氧化的基因转录，而NADH浓度的升高导致Rex与DNA的解离和靶基因的转录阻遏解除。目前国内外对Rex的研究主要集中在它的结构，NADH结合Rex的构型变化，Rex的DNA结合位点的保守性的研究。

目前尚无芽胞杆菌中rex与聚γ-谷氨酸相关性的研究。本申请以地衣芽胞杆菌为例，发现通过在地衣芽胞杆菌中通过敲除rex能够显著提高聚γ-谷氨酸的产量，在芽胞杆菌高产聚γ-谷氨酸方面具有重要的科研意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用，通过敲除地衣芽胞杆菌中rex基因，能够显著提高地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸的产量。

本发明的另一个目的在于提供了一种适用于芽胞杆菌rex缺失株的培养基，利用该培养基对该菌株进行发酵培养，可显著提高聚γ-谷氨酸的产量。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用，包括利用本领域的常规手段敲除地衣芽胞杆菌中rex或使得rex基因沉默或降低rex基因的表达量，通过发酵来提高芽胞杆菌中聚γ-谷氨酸产量。

以上所述的方法中，优选的，所述的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌，优选菌株为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02，CCTCC NO:M208065。

以上所述的应用中，当使用敲除的方式时，优选下述步骤：

(1)采用PCR的方法扩增出地衣芽胞杆菌WX-02的rex基因上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用Xba1和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(2)-ori质粒连接，转化DH5α，对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到rex的敲除载体T2(2)-rex。