[发明专利]用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统及其应用

说明书

本发明公开了一种用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统，所述载体系统含有E3区缺失的人4型腺病毒(Human Adenovirus type 4,HAdV‑4或Ad4)基因组、用于质粒在细菌内扩增的载体序列、pBR322复制原点、卡那霉素抗性基因以及复制控制序列，外源基因嵌入位点位于人4型腺病毒的包装信号之后、E1区之前。本发明还公开了所述单质粒载体系统包装重组人4型腺病毒的方法以及在疫苗和药物制备中的应用。所述载体系统可以快捷、高效地制备稳定表达外源基因的人4型腺病毒载体重组病毒，在诊断试剂盒、疫苗、基因治疗试剂盒和/或肿瘤治疗药物制备的应用等领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体而言，涉及一种重组人4型腺病毒载体系统(Ad4Fast)及其应用。

背景技术

腺病毒为无包膜，正二十面体对称结构，直径70-90nm，其基因组为单股双链DNA，长度约36kb，基因组两端各含有一个反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeats,ITR)，上游末端重复序列内侧含有包装信号用于控制重组病毒的包装。基因组入核后，腺病毒将启动有序而复杂的逐级放大转录和剪切过程，根据转录时间先后可将基因组编码区分为早期转录区(E1-E4)和晚期转录区(L1-L5)。其中，E1区是调节细胞代谢、激活早期基因表达的重要蛋白，E1缺失将导致病毒失去复制能力。E3区的功能主要与病毒逃逸宿主细胞的免疫监视等功能有关，E3缺失不会阻断病毒的复制和装配。

现阶段，复制缺陷型5型腺病毒载体系统广泛应用于疫苗研发、基因治疗、肿瘤治疗等领域。但是，5型腺病毒预存免疫在世界范围内均维持在较高水平，在中国的中和抗体血清阳性率在70％以上。所谓预存免疫是指在疫苗免疫前，机体已经存在的针对载体病毒的免疫反应。往往由野生型载体病毒感染导致，以针对载体病毒的血清中和抗体水平衡量预存免疫水平的高低。在人用腺病毒载体疫苗研究中，5型腺病毒高预存免疫显著影响5型腺病毒载体疫苗诱导的抗原特异性体液和细胞免疫反应。4型腺病毒预存免疫水平显著低于5型腺病毒，且长期作为口服疫苗用于预防腺病毒感染导致的急性呼吸道疾病，具有较高的安全性。因此4型腺病毒载体具有较高的应用价值。本发明的目的就是提供一种能够克服现有技术缺陷、稳定、高效、快速地用于包装重组人4型腺病毒的载体系统

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种复制型人4型腺病毒载体单质粒系统。所述载体系统含有E3区缺失的人4型腺病毒基因组，外源基因嵌入位点位于人4型腺病毒的包装信号之后、E1区之前。

此处的单质粒系统还可以含有用于质粒在细菌内扩增的载体序列、pBR322复制原点、卡那霉素抗性基因以及复制控制序列，这些功能组件是本领域常规技术，不构成本发明的核心内容。

在一个优选的实施方案中，所述载体系统中人4型腺病毒基因组与载体序列之间通过两个PacI限制性酶切位点连接，外源基因的嵌入依赖PmeI限制性酶切位点。

更为优选地，所述载体系统中人4型腺病毒E1区之前的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的4型腺病毒载体骨架质粒，将外源基因表达框或外源基因体外嵌入腺病毒骨架质粒克隆位点，可以直接包装重组病毒。该骨架质粒包含三种形式，分别为：用于嵌入外源基因表达框的载体质粒PAd4-dE3-E1，用于正向嵌入外源基因的载体质粒PAd4-dE3-E1RC、用于反向嵌入外源基因的载体质粒PAd4-dE3-E1LC。

在一个更为优选的实施方案中，所述载体系统在外源基因嵌入位点不含有控制表达元件，携带外源基因表达框的DNA片段直接克隆至所述载体系统的PmeI限制性酶切位点。本载体系统被定义为PAd4-dE3-E1。