[发明专利]基于APN基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于四个APN基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，该试剂盒包含特异引物序列：正、反向引物如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；或如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；或如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；或如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。本发明方法检测周期短，检测数量大，需人力及样品量少，且灵敏度高、特异性强、准确可靠，能有效的检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac的抗性，适合于小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的早期快速诊断，可用于田间小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时监控和预警预报，应用前景广泛。

技术领域

本发明涉及生物领域，涉及小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。

背景技术

小菜蛾Plutella xylostella (L.)，属于鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是一种十字花科蔬菜作物重要害虫，广泛分布于世界各地。小菜蛾主要以幼虫取食寄主植物叶片造成危害，大大降低了蔬菜的产量和质量，个别田块严重发生时可导致绝产。据报道，小菜蛾在全世界范围内每年造成约40-50亿美元的经济损失。目前，田间防治小菜蛾的主要措施仍是叶面喷施杀虫剂。但是小菜蛾繁殖力强和世代周期短的特点使其能对各种杀虫剂快速进化产生抗药性，其中包括生物源农药苏云金芽胞杆菌。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)属于革兰氏阳性杆状细菌，它在产孢过程中能产生多种杀虫蛋白从而高效专一的杀死不同靶标害虫。Bt因其杀虫谱广、高效专一且对人畜环境无害成为世界上产量最大和用途最广的微生物杀虫剂，同时多个编码Bt杀虫蛋白的基因被转入到多种重要经济作物中。多年来，Bt制剂和Bt作物在害虫防治和环境保护中发挥了极其重要的作用。但是Bt的大量和不合理应用导致了害虫对Bt产生抗性。目前在世界范围内已有9种害虫被报道在田间对Bt制剂或Bt作物产生抗性。其中，小菜蛾是世界上第一个被报道在田间产生Bt抗性的害虫，加之小菜蛾基因组测序的完成和公布，使其成为害虫Bt抗性分子机制研究的模式昆虫。因此，小菜蛾Bt抗性机制的研究和抗性关键基因的鉴定为其抗药性检测、监测及预警提供理论支持，同时对Bt的可持续应用以及害虫综合治理具有重要的理论和实践意义。

实时荧光定量PCR (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)，是在普通PCR反应体系中加入荧光染料或者探针，利用荧光信号对整个PCR反应扩增过程进行实时监测和连续分析，最终依据PCR扩增指数期荧光信号达到所设定阈值所需的循环数Ct值与该模板的起始拷贝数之间的线性关系对未知模板进行定量。目前实时荧光定量PCR不仅广泛应用于基础科学研究、疾病诊断以及食品检疫等领域，同时在昆虫Bt抗药性靶标基因转录水平表达量的检测中大规模应用。实时荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、操作简便、高通量等优点，相较于周期长、灵敏度低、操作繁琐的小菜蛾毒力生物测定等常规性检测方法而言，在抗药性检测上显示出强大的应用前景。