[发明专利]基于APN基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测方法及其试剂盒有效
| 申请号： | 201910684686.3 | 申请日： | 2019-07-26 |
| 公开（公告）号： | CN110616267B | 公开（公告）日： | 2022-08-19 |
| 发明（设计）人： | 郭兆将;康师;周君雷;龚莉君;孙丹;覃舰莹;郭乐;朱流红;白杨;张竹竹;叶凡;张友军 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12N15/11;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 北京知本村知识产权代理事务所(普通合伙) 11039 | 代理人： | 刘江良 |
| 地址： | 100081 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 apn 基因 小菜 bt 杀虫 蛋白 cry1ac 抗性 检测 方法 及其 试剂盒 | ||
1.一种检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)提取待测小菜蛾4龄幼虫中肠的RNA样品，并反转录为cDNA模板；
(2)将所述cDNA模板加入到含有特异性引物对的PCR反应液中得到PCR反应体系；所述特异性引物对是以小菜蛾APN6基因为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对，所述特异性引物对由如SEQ ID NO. 11所示的正向引物和如SEQ ID NO. 12所示的反向引物组成；
(3)进行实时荧光定量PCR检测；
对于APN6基因，若所述待测小菜蛾的样品产生典型的“S”型扩增曲线及单峰熔解曲线，且△Ct值≤1，则说明所述小菜蛾待测样品对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性；若△Ct值≥2，则说明待测小菜蛾待测样品未对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性；其中，△Ct值就是靶标APN基因与内参基因RPL32之间的Ct值的差值。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为：95℃预变性15min，95℃变性15sec，53℃退火30sec，72℃延伸32 sec，40个循环。
3.如权利要求2所述的检测方法，其中，PCR过程完成后，按0.1℃•s-1的升温速率从72℃升至95℃进行熔解曲线的分析验证，具体过程为：95℃进行15s，然后60℃进行1min，95℃进行30s，最后60℃进行15s。
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