[发明专利]一种用于评价靶向EGFRvIII抗原的靶细胞U87MG-EGRL及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种用于评价靶向EGFRvIII抗原的靶细胞U87MG‑EGRL及其构建方法和应用，属于细胞免疫技术领域。本发明所述靶细胞U87MG‑EGRL为胶质瘤细胞，能表达CAR‑T细胞靶抗原EGFRvIII基因、GFP和Red Luciferase的融合蛋白基因。本发明所述靶细胞能够高效表达EGFRvIII抗原，既表达GFP基因又表达luciferase基因，可通过luciferase反应评估CAR‑T细胞的杀伤作用，因此可将所述靶细胞应用于体内体外CAR‑T药效学评估。

技术领域

本发明属于细胞免疫技术领域，具体涉及一种用于评价靶向EGFRvIII 抗原的靶细胞U87MG-EGRL及其构建方法和应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T免疫疗法)是最近几年来迅速发展起来的一种新型细胞免疫治疗技术。它是通过基因工程技术，将靶向特异识别(单链抗体scFv)、启动免疫活性和攻击肿瘤细胞的元件整合成一个基因，并将其转导入患者自身T淋巴细胞中，并输回患者体内，使患者重新获得特异性识别肿瘤细胞，激活自身T细胞，有针对性地攻击并杀伤所识别的肿瘤细胞的能力。

脑胶质瘤是最恶性的肿瘤之一，发展进程很快，据统计胶质瘤患者的平均生存期小于15个月，目前没有特别有效的治疗手段。脑胶质瘤病例中有 30％以上的患者有EGFRvIII抗原表达。EGFRvIII是EGFR基因在肿瘤中最常见的突变，公认的肿瘤特异性致瘤突变。EGFRvIII是突变新抗原，在正常组织中不表达，抗原特异性强。靶向EGFRvIII抗原的CAR-T细胞用于治疗脑胶质瘤，特异性强，脱靶毒性低，副作用小，是不错的选择。

细胞治疗产品的复杂性和特殊性常使该类产品在非临床研究和临床研究之间存在较大的种群和个体差异，非临床研究阶段甚至可能没有合适的体内外疾病模型进行药效学评价，因此在早期临床试验阶段初步评估产品有效性是十分必要的。

针对CAR-T免疫治疗的临床前体内体外药效学研究需要合适的评价体系和工具细胞，如何在体外有更好的杀伤效率评价体系，以及如何在体内对肿瘤的体积进行高效正确评估都是有待解决的问题。目前体外杀伤效率的评价方法包括LDH方法、流式方法等，但是都不能准确评估对靶细胞的杀伤效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于评价靶向EGFRvIII的靶细胞U87MG-EGRL及其构建方法和应用，所述靶细胞U87MG-EGRL既高效地表达靶抗原EGFRvIII，同时过表达Red luciferase基因，为CAR-T细胞的体内体外药效学功能验证提供了有效的工具细胞。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于评价靶向EGFRvIII的靶细胞U87MG-EGRL，所述靶细胞U87MG-EGRL为胶质瘤细胞，能表达CAR-T细胞靶抗原EGFRvIII 基因、GFP和Red Luciferase的融合蛋白基因。

优选的，所述EGFRvIII基因由CMV启动子启动表达，所述EGFRvIII 基因具有如SEQID NO.1所示的核苷酸序列。

优选的，所述GFP和Red Luciferase的融合蛋白基因中包括顺次连接的 GFP基因、连接肽基因和Red Luciferase基因，所述GFP和Red Luciferase 的融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了所述靶细胞U87MG-EGRL的构建方法，包括以下步骤： (1)对所述EGFRvIII基因进行修饰，得修饰后的EGFRvIII靶抗原序列；所述修饰后的EGFRvIII靶抗原序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；