[发明专利]一种用于评价靶向EGFRvIII抗原的靶细胞U87MG-EGRL及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 201910682087.8 | 申请日： | 2019-07-26 |
| 公开（公告）号： | CN110305848A | 公开（公告）日： | 2019-10-08 |
| 发明（设计）人： | 焦顺昌;张嵘;宋玉洁 | 申请（专利权）人： | 焦顺昌;北京鼎成肽源生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/867;C12N15/65 |
| 代理公司： | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人： | 瞿晓晶 |
| 地址： | 102200 北京市昌平区双*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 靶细胞 抗原 靶向 构建 应用 融合蛋白基因 胶质瘤细胞 高效表达 杀伤作用 细胞免疫 靶抗原 药效学 评估 体外 体内 基因 | ||
1.一种用于评价靶向EGFRvIII抗原的靶细胞U87MG-EGRL，其特征在于，所述靶细胞U87MG-EGRL为胶质瘤细胞，能表达CAR-T细胞靶抗原EGFRvIII基因、GFP和Red Luciferase的融合蛋白基因。
2.根据权利要求1所述靶细胞U87MG-EGRL，其特征在于，所述EGFRvIII基因由CMV启动子启动表达，所述EGFRvIII基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述靶细胞U87MG-EGRL，其特征在于，所述GFP和Red Luciferase的融合蛋白基因中包括顺次连接的GFP基因、连接肽基因和Red Luciferase基因，所述GFP和Red Luciferase的融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.权利要求1～3任一项所述靶细胞U87MG-EGRL的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对所述EGFRvIII基因进行修饰，得修饰后的EGFRvIII靶抗原序列；所述修饰后的EGFRvIII靶抗原序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(2)用慢病毒转染法将所述GFP和Red Luciferase的融合蛋白基因转入胶质瘤细胞获得表达融合蛋白的U87MG-GRL细胞；
(3)用慢病毒转染法将步骤(1)得到的所述修饰后的EGFRvIII靶抗原序列转入所述U87MG-GRL细胞中，获得靶细胞U87MG-EGRL；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的限制关系。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述修饰，包括在所述EGFRvIII基因的5’端添加NheI酶切位点和Kozak序列，在3’端添加NotI酶切位点。
6.权利要求1～3任一项所述靶细胞U87MG-EGRL或利用权利要求4或5所述构建方法构建得到的靶细胞U87MG-EGRL在靶抗原表达检测中的应用。
7.权利要求1～3任一项所述靶细胞U87MG-EGRL或利用权利要求4或5所述构建方法构建得到的靶细胞U87MG-EGRL在体外检验CAR-T细胞杀伤效果中的应用。
8.权利要求1～3任一项所述靶细胞U87MG-EGRL或利用权利要求4或5所述构建方法构建得到的靶细胞U87MG-EGRL在体内成瘤实验中的应用。
9.根据权利要求6～8任一项所述应用，其特征在于，所述靶细胞U87MG-EGRL在应用时的浓度为(6～10)×103个/mL，效靶比为(1～20)：1。
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