[发明专利]CRISPR多靶标检测方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及CRISPR多靶标检测方法及其试剂盒。具体地，本发明提供了一种利用CRISPR方法快速检测多靶标的方法和试剂盒。具体地，本发明提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，包含：(a)n种具有特定结构的向导RNA‑报告核酸复合探针；和(b)Cas蛋白，所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白。使用本发明所提供的方法，可以同时、快速、准确地检测出同一样本体系中所含有的不同靶标核酸分子。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及CRISPR多靶标检测方法及其试剂盒。

背景技术

利用Cas13或Cas12蛋白的CRISPR诊断方法被誉为下一代检测技术(分别称为SHERLOCK和HOLMES)，因其同时兼具快速、灵敏、特异、简便和廉价的特点。Cas12和Cas13蛋白能用于核酸检测是基于它们旁路(或反式)切割的活力，即在人工设计的向导RNA的引导下，结合特定序列的核酸片段，随之切割单链核酸探针，从而产生可被检测的信号。Cas12和Cas13的差异在于，Cas13蛋白结合RNA标靶并切割RNA探针，而Cas12则结合DNA靶标并切割单链DNA探针。

从原理上来说，若使用Cas13来检测常规的DNA靶标，对靶标DNA进行扩增，并在此过程中引入T7等启动子序列；然后还需要进行体外转录以生成模板RNA，以便Cas13进行识别和结合。此外，在Cas13的检测过程中所使用的RNA报告探针存在较大风险被RNA酶降解，从而导致检测体系的背景信号值较高。相比之下，基于Cas12的检测方法由于无需体外转录也不需要RNA报告探针，因而更具优势。

在一个检测体系中同时检测多个存在靶标的方法和技术对于体外诊断的拓展应用非常重要。目前，基于Cas13蛋白已开发出一种多靶标检测的方法，其关键是利用不同物种来源的Cas13蛋白针对不同RNA报告探针的旁路切割活性不同的特点。然而，Cas12没有这方面特性的研究报导；因此，有必要开发一种全新的方法，利用Cas蛋白进行多靶标核酸的检测。

发明内容

本发明的目的就是提供一种基于CRISPR-Cas蛋白的多靶标检测方法和试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，所述检测体系包含：

(a)n种向导RNA-报告核酸复合探针，所述的向导RNA-报告核酸复合探针具有如式Ia、Ib、Ic或Id所示结构，

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (式Ia)

Z5-Z4-Z3-Z2-Z1 (式Ic)

其中，

Z1为第一茎环结构区；

Z2为无或核酸连接区；

Z3为向导RNA区；

Z5为带可检测标记的单链待切割核酸，其中，所述的可检测标记在所述单链待切割核酸被切割和未被切割的情况下，呈现不同的检测状态从而被检测出；

其中，当靶标核酸不存在于所述检测体系时，Z3与Z5形成一互补配对的双链结构区；而当靶标核酸存在于所述检测体系时，Z3与Z5不形成所述的互补配对的双链结构区；

Z4为无、或用于连接Z3和Z5的化学键或连接区；

为碱基互补配对的氢键；

并且，n为n≥1的正整数；和

(b)Cas蛋白，所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白。

在另一优选例中，所述的Cas蛋白选自下组：Cas12型、Cas13a型、Cas13b型、Cas14型、或其组合。