[发明专利]CRISPR多靶标检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，其特征在于，所述检测体系包含：

(a)n种向导RNA-报告核酸复合探针，所述的向导RNA-报告核酸复合探针具有如式Ia、Ib、Ic或Id所示结构，

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (式Ia)

Z5-Z4-Z3-Z2-Z1 (式Ic)

其中，

Z1为第一茎环结构区；

Z2为无或核酸连接区；

Z3为向导RNA区；

Z5为带可检测标记的单链待切割核酸，其中，所述的可检测标记在所述单链待切割核酸被切割和未被切割的情况下，呈现不同的检测状态从而被检测出；

其中，当靶标核酸不存在于所述检测体系时，Z3与Z5形成一互补配对的双链结构区；而当靶标核酸存在于所述检测体系时，Z3与Z5不形成所述的互补配对的双链结构区；

Z4为无、或用于连接Z3和Z5的化学键或连接区；

为碱基互补配对的氢键；

并且，n为n≥1的正整数；和

(b)Cas蛋白，所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白。

2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的Cas蛋白选自下组：Cas12型、Cas13a型、Cas13b型、Cas14型、或其组合。

3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述体系中：

(i)n≥2，并且n为正整数；

(ii)所述的可检测标记为荧光基团，并且Z5带有荧光基团，而所述Z4和/或Z5中还带有淬灭基团，当且仅当所述的单链待切割核酸被切割时，可检测到荧光基团所发出的荧光信号；和/或

(iii)在所述的n种向导RNA-报告核酸复合探针中，所述的荧光基团两两不同，从而可被区分。

4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述Z3中包含可以引导所述Cas蛋白特异性结合靶标核酸分子的核酸序列。

5.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述Z5为DNA单链核酸序列，或者RNA单链核酸序列，或同时具有RNA和DNA的核酸序列。

6.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的检测包括：定性检测或定量检测。

7.一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

i)第一容器以及位于第一容器内的n种具有如式Ia、Ib、Ic或Id所示结构的向导RNA-报告核酸复合探针，

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (式Ia)

Z5-Z4-Z3-Z2-Z1 (式Ic)

其中，

Z1为第一茎环结构区；

Z2为无或核酸连接区；

Z3为向导RNA区；

Z5为带可检测标记的单链待切割核酸，其中，所述的可检测标记在所述单链待切割核酸被切割和未被切割的情况下，呈现不同的检测状态从而被检测出；

其中，当靶标核酸不存在于所述检测体系时，Z3与Z5形成一互补配对的双链结构区；而当靶标核酸存在于所述检测体系时，Z3与Z5不形成所述的互补配对的双链结构区；

Z4为无、或用于连接Z3和Z5的化学键或连接区；

为碱基互补配对的氢键；

并且，n为n≥1的正整数；

ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas蛋白，所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割活性的Cas蛋白；

iii)任选的第三容器以及位于第三容器中的缓冲液。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

iv)第四容器以及位于第四容器内的用于扩增靶标DNA的聚合酶；

v)任选的第五容器以及位于第五容器内的用于反转录的反转录酶和/或用于转录的转录酶；

vii)第六容器以及位于第六容器内的用于扩增反应和/或反转录反应的dNTPs和/或用于转录反应的NTPs。