[发明专利]一种利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

说明书

一种利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤：从青蒿中克隆水杨酸信号途径AaTGA6基因，构建含AaTGA6基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将AaTGA6基因转入青蒿并再生出植株，PCR检测外源目的基因AaTGA6的整合情况，再测定转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的1.9倍，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体涉及的是一种提高青蒿素含量的方法，特别涉及是一种利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。

经对现有技术文献检索发现，Gao-Bin Pu等在《Plant Cell Reports》 (《植物细胞报告》，2009年28期1127-1135页)发表了题为“Salicylic acid activates artemisininbiosynthesis in Artemisia annua L.”(“水杨酸能激活青蒿中青蒿素的生物合成”)的论文，报道通过外源激素水杨酸处理青蒿植株，使青蒿中青蒿素合成途径基因ADS的表达量提高，青蒿素含量提高了 1.27倍。因此，通过过表达水杨酸信号途径的基因为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一条可行的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，将青蒿中克隆出的AaTGA6基因转入青蒿中得到转基因AaSPL2 青蒿，该转基因AaTGA6青蒿中青蒿素含量显著提高，从而实现利用青蒿大规模生产青蒿素。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明从青蒿中克隆AaTGA6基因，构建含AaTGA6基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将AaTGA6 基因导入青蒿并再生出植株；PCR检测外源目的基因AaTGA6的整合情况，高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

本发明提供的利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤：

S1：采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因AaTGA6；

S2：把AaTGA6基因可操作性地连接于表达调控序列，构建含AaTGA6 基因的植物表达载体；

S3：将含AaTGA6基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaTGA6基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

S4：利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测为阳性的转基因青蒿植株；

S5：对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。