[发明专利]一种利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

权利要求书

1.一种利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤：

S1：采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因AaTGA6；

S2：把AaTGA6基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaTGA6基因的植物表达载体；

S3：将含AaTGA6基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaTGA6基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

S4：利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测为阳性的转基因青蒿植株；

S5：对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。

2.根据权利要求1所述的利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，步骤S1包括如下步骤：提取青蒿基因组总RNA；将青蒿基因组总RNA通过反转录获得第一链cDNA；以所述第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序，获得测序正确的青蒿AaTGA6基因；PCR扩增时根据SEQ ID NO.1所示的DNA序列，设计扩增出完整编码框的上、下游引物，所述上、下游引物的核苷酸序列分别为：

TGA6-PF：atgggtagcaaaagcttgaag，TGA6-PR：ttactcttgtgggcgagcaag。

3.根据权利要求1所述的利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，步骤S2中，所述构建含AaTGA6基因的植物表达载体包括如下步骤：选用pBI121和pCAMBIA2300为基本元件，构建双元植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos；再用BamHI和SacI双酶切载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos，回收pCAMBIA2300::p35S-nos大片段，将AaTGA6基因交换到pCAMBIA2300::p35S-nos上形成pCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300::p35S-gus-AaTGA6-nos，转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。

4.根据权利要求3所述的利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述构建双元植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos包括如下步骤：用HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA2300质粒；回收pBI121的gus表达盒和pCAMBIA2300大片段；连接回收产物，转化筛选，抽质粒酶切验证。

5.根据权利要求1所述的利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，步骤S4中，所述转化包括如下步骤：外植体的预培养；农杆菌与外植体的共培养；抗性再生植株的筛选。

6.根据权利要求5所述的利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述外植体的预培养包括如下步骤：青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中，25℃下光照培养16h、暗培养8h，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5～8cm后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

7.根据权利要求5所述的利用AaTGA6基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述农杆菌与外植体的共培养包括如下步骤：将所述无菌苗叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化好的所述含AaTGA6基因植物双元表达载体pCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300::p35S-gus-AaTGA6-nos的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。