[发明专利]一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用

说明书

本发明涉及一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用，包括胰蛋白酶镜像酶(胰蛋白酶N端羧肽酶)酶切甲基化修饰和无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸N端肽键、肽段N末端α氨基的选择性标记、trypsin等酶切无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸C端肽键、氨基活性材料辅助去除无甲基化修饰肽段及LC‑MS/MS分析。本发明的优点是一种不依赖抗体的蛋白质甲基化富集方法，实现赖氨酸单甲基化修饰、赖氨酸二甲基化修饰、赖氨酸三甲基化修饰、精氨酸单甲基化修饰以及精氨酸二甲基化修饰同时富集。

技术领域

本发明涉及一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用，实现了蛋白质赖氨酸甲基化修饰和精氨酸甲基化修饰的富集和质谱鉴定。

背景技术

蛋白质甲基化修饰是一种可逆的翻译后修饰，广泛存在于真核和原核生物中，蛋白质甲基化修饰参与了生物体的多种生命过程，与基因的转录调控、RNA剪切、DNA损伤修复、代谢、信号传导等密切相关。蛋白质甲基化修饰的形式具有多样性，可以在多种氨基酸上进行甲基化修饰，如可以发生在赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸以及甲硫氨酸上。蛋白质甲基化修饰不仅发生在多种氨基酸上，在同一种也具有不同的修饰形式，如在赖氨酸上可以发生单甲基化修饰、二甲基化修饰以及三甲基化修饰。尽管甲基化修饰可以发生在多种氨基酸上形成多种形式的甲基化修饰，目前对蛋白质甲基化修饰的研究主要集中在赖氨酸甲基化修饰和精氨酸甲基化修饰，这两种修饰在调控染色体的结构以及基因的表达中发挥着重要作用。蛋白质甲基化修饰的调控异常与多种疾病存在着密切的联系，如蛋白质甲基化修饰调控异常与乳腺癌、肺癌、淋巴癌、艾滋病以及心血管疾病等密切相关，这提示甲基化修饰底物有可能作为疾病的生物标志物存在以及蛋白质甲基化转移酶是很有潜力的药物靶标。因此，解析生物体内的甲基化修饰底物及其相互作用网络对研究疾病发生发展的生理和病理机制具有重要作用，为药物的研发以及防止各种疾病提供有益的信息。

尽管蛋白质甲基化修饰研究已经很久了，与蛋白质磷酸修饰、糖基化修饰以及乙酰化修饰相比，甲基化修饰引起的物理化学性质改变很小，因此蛋白质甲基化修饰的鉴定目前依然存在很大的挑战。为了实现蛋白质甲基化修饰的高通量富集以及鉴定，近些年发展了多种原理的蛋白质甲基化修饰富集手段，结合基于质谱技术的蛋白质组学技术，实现了蛋白质甲基化的底物系统性鉴定。常用的蛋白质甲基化修饰富集原理主要包括抗体亲和富集策略、甲基化识别结构域富集策略以及基于色谱原理的甲基化富集策略。目前，抗体亲和富集策略是甲基化修饰肽段的富集最为成功的研究办法是抗体亲和富集策略，Larsen等(Science signaling 2016,9,rs9)利用抗精氨酸甲基化修饰抗体在人肾上皮293细胞中的3300个蛋白质上鉴定出 8030个蛋白质精氨酸单甲基化修饰位点信息。抗体亲和富集在蛋白质精氨酸甲基化修饰研究中取得很大的成功，但是利用抗体亲和富集方法对蛋白质赖氨酸甲基化修饰进行分析还存在很大的挑战。在 2013年，Cao等(Epigenetics 2013,8,477-485)开发三种针对赖氨酸甲基化修饰的抗体，结合SCX分级，鉴定出552个蛋白质赖氨酸甲基化修饰位点；于2016年，Cao等(Current protocols in protein science 2016,86)进一步优化实验条件，在30mg蛋白质中鉴定出 1000多个蛋白质赖氨酸单甲基化修饰位点。生物体内存在多个氨基酸互换以及翻译后修饰与甲基化修饰具有相同元素组成，Cao等没有使用稳定同位素¹³CD₃-甲硫氨酸标记，大大增加甲基化修饰位点鉴定误差。为了提高蛋白质赖氨酸单甲基化修饰鉴定效率以及鉴定可靠性，于Wu等(MolecμLarcellμLar proteomics:MCP 2015,14, 329-339)利用化学蛋白质手段建立了一个能够实现蛋白质单甲基化修饰高效富集的方法，Wu等利用丙酸酐对蛋白质进行丙酰化标记，从而将赖氨酸单甲基化修饰转变为赖氨酸丙酰甲基化修饰，提高了抗原性，开发出抗赖氨酸丙酰甲基化修饰的泛抗体，结合稳定同位素¹³CD₃-甲硫氨酸标记以及高pH值RP-HPLC分级，最终在398个蛋白质上鉴定出446个赖氨酸单甲基化修饰位点，这446个甲基化修饰位点具有很高的可靠性，因为不仅使用了稳定同位素¹³CD₃-甲硫氨酸标记，而且对甲基化修饰肽段的二级谱图进行手工检查，从而保证了每个二级谱具有很高的可靠性。亲和富集的选择性和鉴定结果多依赖于抗体，然而不同批次以及不同商家的抗体难以保证抗体很好的重现性。赖氨酸甲基化修饰的结构域有克罗莫结构域 (chromodomain)、帝陀结构域(tudor domain)和MBT结构域 (malignantbrain tumor domain)，其中克罗莫结构域和MBT结构域已经成功应用于蛋白质甲基化修饰的富集，Moore等(Molecular cell 2013,50,444-456)采用GST-3×MBT融合蛋白质对人肾上皮 293T细胞的甲基化修饰蛋白质进行富集，在313个蛋白质上仅仅鉴定到26个甲基化修饰位点信息；Liu等(Molecular cell 2013,50, 723-735)利用赖氨酸甲基化修饰识别结构域(methyllysine recognizing domain：MRD domain)在29个蛋白质上鉴定出40个赖氨酸甲基化修饰位点。虽然甲基化修饰识别结构域可以对甲基化修饰蛋白质和甲基化修饰肽段进行富集，但是从总体上看，鉴定出的甲基化修饰位点信息较少。2012年，Uhlmann等(Molecular cellular proteomics:MCP 2012,11,1489-1499)比较了亲水作用色谱(HILIC)、强阳离子交换色谱(SCX)以及等电聚焦(IEF)对甲基化修饰肽段的富集效果，结果显示HILIC具有更好的富集效果，利用HILIC鉴定出215个精氨酸甲基化修饰位点，而SCX和IEF分别鉴定出39个和66个甲基化修饰位点信息；Wang等(Analytical chemistry 2017,89,12909-12917)优化酶切条件以及SCX分离条件，建立了基于SCX的蛋白质甲基化修饰分析方法，利用该方法，在人肝癌细胞HepG2中鉴定出768个甲基化修饰位点；Ma等(Analytical chemistry 2017,89,12909-12917)建立了基于HILIC原理的DOMAIN(de-glyco-assisted methylation site identification)方法，在人非小细胞肺癌A549细胞中鉴定出573个甲基化修饰类型。尽管基于色谱原理的蛋白质甲基化修饰富集策略在富集选择方面还无法达到抗体亲和富集的效果，但其成本较低,重现性较好,使其成为蛋白质甲基化修饰分析中的可靠方法。