[发明专利]一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用

权利要求书

1.一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用胰蛋白酶N端羧肽酶酶切蛋白质甲基化修饰和无甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N段肽键；

（2）对步骤（1）得到的肽段进行N端α氨基的选择性标记；在pH为1-5条件下，使用醛基化合物对肽段N端的α-氨基进行标记反应；

（3）对步骤（2）得到的N端α氨基的选择性标记的肽段中的无甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸C端肽键进行特异性酶切，使无甲基化修饰肽段产生一个N端自由α氨基；

（4）继续使用氨基活性材料去除含有N端自由α氨基的无甲基化修饰肽段，分离氨基活性材料实现赖氨酸甲基化修饰和精氨酸甲基化修饰肽段的反向富集，得到甲基化修饰的肽段；所述的氨基活性材料为与氨基进行共价反应的材料；

（5）采用LC-MS/MS分析得到的甲基化修饰肽段。

2.按照权利要求1所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法，其特征在于：步骤（3）进行酶切时，包括：采用胰蛋白酶，或将胞内蛋白酶和梭菌蛋白酶联合使用，或者胞内蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶联合使用，实现无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸C端肽键的水解。

3.按照权利要求1所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法，其特征在于：步骤（4）中：利用醛基或者活性酯与氨基的反应，将无甲基化修饰肽段固定到氨基活性材料上，通过分离氨基活性材料实现甲基化修饰肽段的富集；步骤（4）包括：将氨基活性材料与步骤（3）酶切后得到的肽段进行孵育，调节pH为3-12，25 °C -50 °C反应0.16h-24 h。

4.按照权利要求1所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法，其特征在于：步骤（5）采用LC-MS/MS分析得到的甲基化修饰肽段包括：利用反向C18-LC对肽段进行分离，利用ESI电离方式对分离的肽段进行离子化，通过高分辨率质谱分析离子化的肽段一级谱和二级谱，并利用搜索软件对质谱数据进行解析，从而鉴定出甲基化修饰肽段的信息。

5.按照权利要求1所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法，其特征在于：步骤（1）中对蛋白质进行酶切时，酶用量为蛋白质质量的1/5-1/500，25 °C -65°C，酶解2-48 h，酶解体系pH为6-9。

6.按照权利要求1所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法，其特征在于：所述醛基化合物为甲醛或乙醛，标记时醛基化合物终浓度为5 mM-1000 mM，反应温度为4 °C -37 °C，反应时间为0.16h-48 h，pH为1-5。

7.按照权利要求2所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法，其特征在于：进行酶切，酶用量为蛋白质质量的1/5-1/500， 25 °C -50 °C，酶解2-48 h，酶解体系pH为6-9。

8.按照权利要求3所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法，其特征在于：所述的氨基活性材料为含有醛基的材料和活性酯的材料，包括N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖、溴化氰活性琼脂糖、异氰酸树脂、醛基功能化材料中的一种或二种以上。

9.按照权利要求4所述的基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法，其特征在于：高分别率质谱仪，包括Orbitrap Elite、Q Exactive、Q Exactive Focus、QExactive Plus、Q Exactive HF-X、Orbitrap Fusion Tribrid、Orbitrap Fusion LumosTribrid；对甲基化进行数据解析的搜索软件包括Mascot、MaxQuant、pFide、SEQUEST，PEAKS中的一种或二种以上。