[发明专利]一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法

说明书

本发明公开了一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法。选取微量贝类鳃丝组织，仅需细胞裂解液和蛋白酶K，进行细胞裂解、蛋白质消化，稀释上清，由此得到的基因组DNA，可以直接用来制备高通量测序文库。DNA提取所需的组织量低至5mg，操作简便快速，尤其适用于微量组织的高通量测序文库制备；利用该DNA样品制备的文库进行测序获得基因分型数据，分型准确性达99.94％。本发明DNA提取操作时间不超过30分钟，提取的DNA适用于大批量贝类微量样品的高通量测序文库的制备及后续全基因组分型分析。

技术领域

本发明涉及脱氧核糖核酸提取与分子标记分型技术领域，更具体的说是涉及一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法。

背景技术

目前，贝类占我国海产养殖总量近80％，是我国海水养殖的支柱性产业。近年来随着生物高新技术的迅猛发展，如何高效利用基因组学与遗传信息学应用于贝类优良种质创制，已成为贝类遗传育种领域的前沿焦点问题。另外，开展全基因组范围的SNP标记分型能够为砗磲等珍贵的贝类资源的种质资源分析和遗传资源的开发和保护等方面提供丰富的数据信息。

随着测序成本的降低和文库构建流程的标准稳定化，GBS、RAD、2b-RAD等简化基因组测序技术作为一种高效标记开发技术已然成为贝类等非模式生物大规模群体的SNP位点基因型筛查和分析的主流技术，推动了群体遗传学、遗传图谱构建及数量性状位点定位等方面的研究进展。简化基因组技术对于贝类的分子育种和多样性保护等方面具有重要的科研价值和产业价值。

但是，在相关领域的应用仍存在一定挑战。究其原因，这类技术大都是通过酶切的方式获得代表性的标签序列，从而实现降低基因组的复杂度。测序文库制备的首要步骤是对基因组DNA进行酶切处理，文库制备对于DNA的起始量和质量的要求较高。通常分子育种所涉及的选育亲本和濒危保护贝类的研究获取组织的方式都以不影响生物体存活状态为前提，通过这类方式获取的组织微量，提取的DNA量少，一般不能直接用来制备高通量测序文库。目前尚未有文献报道可用于高通量测序文库制备的微量组织基因组DNA的快速、简便、有效的提取方法。

针对海洋软体动物的的DNA提取方法主要分为两种：一种是以传统酚-氯仿抽提法和试剂盒为代表的，该方法可以得到主带完整、纯净的基因组DNA，需要大量样品材料，可能会导致贝类死亡或造成畸形伤害，并且成本较高，因而不适用于分子标记辅助育种等需要维持研究对象良好生长状况的研究领域；另一种是以贝类DNA快提法为代表的一类技术可以在不影响活体扇贝生存情况下，短时快速获得基因组DNA用于普通PCR检测，但该方法获得的DNA均有不同程度的降解，并且含有较多SDS、蛋白酶K等酶抑制剂，容易影响内切酶的活性，无法保证高通量测序文库的制备质量，所以通过该方法获取DNA的方式并不能直接转化到制备高通量测序文库的应用中。

因此，如何从离体的微量贝类组织提取DNA并适用于高通量测序文库制备是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法

(1)配制细胞裂解液和蛋白酶K混合液；

(2)选取5.0mg贝类离体鳃丝，浸泡在步骤(1)所述细胞裂解液和蛋白酶K混合液中；

(3)步骤(2)得到的反应体系放置于37-65℃水浴锅中消化，直至澄清；

(4)待消化完毕后，吸取上清液，稀释，得到可用于高通量测序文库制备的基因组DNA样品；

(5)用步骤(4)获得的基因组DNA样品构建Miso-RAD测序文库；

(6)利用双端测序平台对步骤(5)构建的Miso-RAD文库进行高通量测序；