[发明专利]一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法有效
| 申请号： | 201910668292.9 | 申请日： | 2019-07-23 |
| 公开（公告）号： | CN110343742B | 公开（公告）日： | 2023-03-21 |
| 发明（设计）人： | 王师;张天琦;刘平平;吕佳;马岑;包振民 | 申请（专利权）人： | 中国海洋大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 崔自京 |
| 地址： | 266000 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 通量 序文 制备 微量 贝类 dna 提取 方法 | ||
1.一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)配制细胞裂解液和蛋白酶K混合液；
(2)选取5.0mg贝类离体鳃丝，浸泡在步骤(1)所述细胞裂解液和蛋白酶K混合液中；
(3)步骤(2)得到的反应体系放置于37-65℃水浴锅中消化，直至澄清；
(4)待消化完毕后，吸取上清液，稀释，得到可用于高通量测序文库制备的基因组DNA样品；
(5)用步骤(4)获得的基因组DNA样品构建Miso-RAD测序文库；
(6)利用双端测序平台对步骤(5)构建的Miso-RAD文库进行高通量测序；
(7)对步骤(6)获得的测序数据进行处理与分析；
所述步骤(1)中细胞裂解液pH＝8.0，组分为100mM NaCl、10mM Tris-HCl和1mM EDTA；最终混合液中蛋白酶K终浓度为0.1μg/μl；
所述贝类为瓣鳃纲；
所述步骤(3)中水浴温度为56℃，水浴消化时间为1.0小时；每30min将所述鳃丝、所述细胞裂解液和所述蛋白酶K混匀；
所述步骤(4)稀释为向上清液中加入灭菌三蒸水，上清液与灭菌三蒸水的体积比例是1:49。
2.根据权利要求1所述的一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于：所述步骤(5)用于制备Miso-RAD测序文库的起始入口量为2-5ul的稀释液。
3.根据权利要求1所述的一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于：所述步骤(5)构建Miso-RAD测序文库，步骤包括：BsaXI酶切与检测、灭活内切酶、T4DNA连接酶连接、一轮PCR富集、样品检测与回收纯化、再次扩增、LguI酶酶切、T4DNA连接酶连接、加barcode标记进行PCR扩增。
4.根据权利要求1所述的一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(7)处理与分析为：按照序列不含N、序列80％以上碱基的质量值20原则对原始reads进行质量过滤，再用RADtyping软件对基因组范围内SNP位点实现基因分型。
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