[发明专利]一种基于双酶切的简化基因组测序文库的构建方法

说明书

本发明提供了一种基于双酶切的简化基因组测序文库的构建方法，属于全基因组重测序技术领域，包括利用限制性内切酶MspI和MseI对基因组DNA进行酶切，将接头序列分别连接到酶切产物上，得到连接产物；将连接产物进行等质量混合，将得到的混合物进行双轮磁珠分选，得到350bp的片段；以得到的片段为模板，用引物对进行PCR扩增，将得到的扩增产物纯化后，构建得到基于双酶切的简化基因组测序文库；所述引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。采用本发明提供的构建方法最终开发的SNP位点有225,744个，提高了SNP位点的开发。

技术领域

本发明属于全基因组重测序技术领域，尤其涉及一种基于双酶切的简化基因组测序文库的构建方法。

背景技术

全基因组重测序为基因组开发的分子标记在全基因组水平上通量高、覆盖度广，是一种快捷有效的技术手段。基于重测序数据的SNP开发与以往的标记系统相比具有许多优点，包括分布密度高、标记丰富、遗传性稳定性好、二等位基因型等特点。然而重测序样品建库成本高，限制在群体规模上的应用。而简化基因组测序技术为各物种开发高密度SNP标记，提供一个经济而高效的平台。

简化基因组测序主要通过使用核酸内切酶来降低基因组的复杂性，它是指利用限制性内切酶将全基因组进行酶切打断，得到一定范围片段大小的文库，将酶切产生的片段作为全基因组研究的简化代表，降低基因组的复杂性。并且使用标签序列系统来区别模板DNA来生成多样品测序文库，是群体全基因组SNP开发的比较经济的方法。该技术的应用不仅针对已知参考基因组的物种，也适用于无参考基因组的物种研究。

采用(Poland JA,Brown PJ,Sorrells ME,Jannink JL.Development of high-density genetic maps for barley and wheat using a novel two-enzymegenotyping-by-sequencing approach.PLoS One,2012,7(2):e32253.doi:10.1371/journal.pone.0032253.)公开的方法，利用两种限制性内切酶PstI和MspI对六个巨桉样品开展GBS建库测序，最终开发的SNP位点仅73,621个。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于双酶切的简化基因组测序文库的构建方法，采用本发明提供的构建方法最终开发的SNP位点有225,744个。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种基于双酶切的简化基因组测序文库的构建方法，包括以下步骤：

1)提取6个不同个体巨桉叶片的基因组DNA，利用限制性内切酶MspI和MseI对得到的基因组DNA分别进行酶切，得到酶切产物；

2)将接头序列分别连接到步骤1)得到的酶切产物上，得到连接产物；

所述接头序列包括GTACA、TACGC、AGTCA、GCATC、CTGAA和CATCG，1个接头序列连接到1个酶切产物上；

3)将所述步骤2)分别得到的连接产物进行等纳摩尔量混合，将得到的混合物进行双轮磁珠分选，得到350bp的片段；

4)以所述步骤3)得到的片段为模板，用引物对进行PCR扩增，将得到的扩增产物纯化后，构建得到基于双酶切的简化基因组测序文库；

所述引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的序列如SEQ IDNo.2所示。

优选的，所述步骤1)酶切的条件包括：37℃水浴4h；65℃失活20min。