[发明专利]一种基于双酶切的简化基因组测序文库的构建方法

权利要求书

1.一种基于双酶切的简化基因组测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取6个不同个体巨桉叶片的基因组DNA，利用限制性内切酶MspI和MseI对得到的基因组DNA分别进行酶切，得到酶切产物；

2)将接头序列分别连接到步骤1)得到的酶切产物上，得到连接产物；

所述接头序列包括GTACA、TACGC、AGTCA、GCATC、CTGAA和CATCG，1个接头序列连接到1个酶切产物上；

所述1个接头序列连接到1个酶切产物上为接头序列GTACA、TACGC、AGTCA、GCATC、CTGAA和CATCG分别连接到编号为巨桉1～6的酶切产物上；

3)将所述步骤2)分别得到的连接产物进行等纳摩尔量混合，将得到的混合物进行双轮磁珠分选，得到350bp的片段；

4)以所述步骤3)得到的片段为模板，用引物对进行PCR扩增，将得到的扩增产物纯化后，构建得到基于双酶切的简化基因组测序文库；

所述引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)酶切的条件包括：37℃水浴4h；65℃失活20min。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)连接使用体系每50μL包括：酶切产物30μL、接头序列5μL、T4 Ligation Buffer4μL、T4 DNALigase 0.5μL和dd H₂O10.5μL。

4.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于，所述连接的条件包括：22℃连接2h；65℃失活20min。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)PCR扩增使用的体系每25μL包括：片段10μL、5×NEB mix 5μL、上游引物1μL、下游引物1μL和dd H₂O 8μL。

6.根据权利要求1或5所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：95℃预变性30s；95℃变性30s、62℃退火20s、68℃延伸30s，共计16个循环；72℃延伸5min。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)纯化采用柱式纯化的形式进行。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述连接产物的浓度使用Qubit 3.0进行测定。