[发明专利]一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法

权利要求书

1.一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）标准品储备液的配制

分别精密称取人参皂苷Rg1、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA、芒果苷、知母皂苷BII、柚皮苷、甘草苷、甘草酸各10mg，分别置于10ml容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，并定容至刻度线，分别制得1.00mg/ml标准品储备液；

（2）内标工作液的配制

精密称取多潘立酮1mg于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容配成0.1mg/mL储备液；精密移取内标储备液适量，用甲醇稀释，配成浓度为0.1μg/mL的内标溶液；

（3）标准曲线的制备

用大鼠空白血浆，将步骤（1）的各标准品储备液配制成7个终浓度的系列血浆标准曲线样品：人参皂苷Rg1 1.3-650ng/mL；丹酚酸B 5.0-2495ng/mL；隐丹参酮4.5-2250ng/mL；丹参酮IIA 2.0-1000ng/mL；芒果苷4.5-2250ng/mL；知母皂苷BII 5.0-2250ng/mL；柚皮苷5.0-2497.5ng/mL；甘草苷2.5-1252.5 ng/mL；甘草酸1.5-751.2ng/mL；

分别取各系列血浆标准曲线样品，加入步骤（2）的内标物，并加入甲酸，混匀，加入乙酸乙酯提取，离心，取上清液在离心浓缩仪上挥干，残渣用甲醇复溶，离心，取上清液注入液相色谱串联质谱法中进行分析；以待测物与内标的峰面积之比值Y为纵坐标，以待测物浓度X为横坐标，采用加权最小二乘法进行回归计算，得各标准曲线，计算权重为1/X²；

（4）血浆样品处理：

取灌胃双参平肺颗粒的大鼠待测血浆样品，加入步骤（2）的内标物，并加入甲酸，涡旋混匀，加入乙酸乙酯超声提取5min，13000rpm离心10min，取上清液在离心浓缩仪上挥干，残渣用70%甲醇复溶，超声2min，13000rpm离心10min，取上清液作为血浆测试样品；

（5）含量测定：

取步骤(4)得到的血浆测试样品进样，采用液相色谱串联质谱法进行分析，记录各待测成分和内标的峰面积，代入步骤（3）制得的回归方程中，检测血浆中芒果苷、丹参酮IIA、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、柚皮苷、甘草苷、隐丹参酮、知母皂苷BII和甘草酸的含量；

液相色谱条件为：ACQUITY^TM UPLC超高效液相色谱系统，ACQUITY^TM UPLC BEH C18色谱柱，规格：2.1mm×100mm, 填料直径：1.7μm，柱温：35℃;流动相：0.1%甲酸水溶液为A相，乙腈为B相，梯度洗脱：0-1min，10%→30%B；2-7min，30%B→95%B；7-8.2min, 95%→10%B，流速为0.4mL/min，进样体积为5μL，检测时间为8min；

质谱条件为：Xevo^TM TQ质谱系统，离子源ESI源，扫描方式为多反应监测MRM方式，毛细管电压3kV，离子源温度150℃，去溶剂气温度550℃；

MRM监测扫描方式为：

芒果苷：离子化方式：ESI⁺，定量离子对423.22→273.10，锥孔电压：30V，碰撞能量：28eV，保留时间(t_R)：2.16min；

丹参酮IIA：离子化方式：ESI⁺，定量离子对295.22→277.22，锥孔电压：28V，碰撞能量：20eV，保留时间(t_R)：5.82min；

人参皂苷Rg1：离子化方式：ESI^-，定量离子对845.53→799.49，锥孔电压：80V，碰撞能量：35eV，保留时间(t_R)：2.91min；

丹酚酸B：离子化方式：ESI^-，定量离子对717.28→519.16，锥孔电压：26V，碰撞能量：18eV，保留时间(t_R)：3.08min；

柚皮苷：离子化方式：ESI^-，定量离子对579.29→271.12，锥孔电压：40V，碰撞能量：28eV，保留时间(t_R)：2.89min；

甘草苷：离子化方式：ESI⁺，定量离子对419.16→136.94，锥孔电压：28V，碰撞能量：20eV，保留时间(t_R)：2.64min；

隐丹参酮：离子化方式：ESI⁺，定量离子对297.16→251.11，锥孔电压：30V，碰撞能量：26eV，保留时间(t_R)：5.54min；

知母皂苷BII：离子化方式：ESI^-，定量离子对919.58→757.51，锥孔电压：85V，碰撞能量：40eV，保留时间(t_R)：2.90min；

甘草酸：离子化方式：ESI⁺，定量离子对823.35→453.35，锥孔电压：18V，碰撞能量：30eV，保留时间(t_R)：3.91min；

内标物为多潘立酮：离子化方式：ESI⁺，定量离子对426.16→175.09，锥孔电压：75V，碰撞能量：35eV，保留时间(t_R)：3.18min。