[发明专利]一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法及应用

说明书

本发明公开了一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法及应用。本发明采用V8酶结合V8酶和赖氨酰肽链内切酶联用，特异性水解胰岛素，通过液质联用仪建立含有胰岛素特征性片段的肽图。方法建立：使用缓冲液提供pH7.5～9.5的酶解环境，底物与酶按胰岛素:V8酶:赖氨酰肽链内切酶≈（100～1000）:（100～500）:1的质量比进行反应过夜，反应液稀释10～30倍，采用液相分离质谱检测器检测，建立各品种胰岛素的特征肽图谱。采用本发明的质谱肽图谱，可以准确的确定各种不同胰岛素，方法准确可靠。

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种胰岛素酶解质谱肽图谱的建立方法及应用。

背景技术

胰岛素类重组产品是目前针对糖尿病最有效和最安全的治疗手段。我国人口基数大，糖尿病患者数量多，胰岛素使用量大。虽然重组技术含量高，生产过程复杂，但在丰厚利润驱动下，存在不法商贩利用动物源性胰岛素以假乱真的风险。目前现行质量标准中，对于重组胰岛素真伪的鉴别采用的是保留时间一致性进行鉴别，而不同种类重组胰岛素分子间结构及其相似，保留时间非常相近，实际鉴别操作过程中存在着一定的困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法。本发明采用合适的酶解方法，辅以质谱检测，建立各类胰岛素的酶解质谱肽图将大大提高鉴别的准确可靠性，提高胰岛素的鉴别能力，为胰岛素的打假工作提供有力技术支持。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）使用V8酶结合V8酶与赖氨酰肽链内切酶联用酶解方法鉴别各种胰岛素，所述胰岛素包括人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素以及猪胰岛素；

（2）水解条件：采用Tris-Hcl缓冲液提供pH7.5～9.5的酶解环境；

（3）V8酶与赖氨酰肽链内切酶反应液的配制：按照胰岛素:V8酶:赖氨酰肽链内切酶≈（100～1000）:（100～500）:1的质量比分别配制反应液；

（4）色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以（0.1%～1%）甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱，流速为（0.2～0.6）ml/min，柱温50～60℃，质谱检测器；

表1 流动相梯度洗脱条件(体积比)

（5）测定法：取酶解样品注入液质联用仪，进行数据采集，测定酶解多肽片段的质谱图。

本发明所述的鉴别方法，其特征在于建立多种胰岛素在两种酶解条件下的特征质谱肽图，为人胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、谷赖胰岛素、赖脯胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素等。

本发明使用质谱检测器在50~2000Da范围内连续扫描，制定多种胰岛素的酶解质谱肽图。

按照本发明测定胰岛素的质谱肽图，部分胰岛素特征质谱理论片段结果如下表2、表3：

表2 胰岛素V8酶水解理论片段总结表

表3胰岛素在V8酶与赖氨酰肽链内切酶联用条件下水解理论片段总结表

本发明所述的胰岛素质谱肽图谱建立包含原料和制剂。其中质谱检测得到4个特征肽段。分别是肽段Ⅰ、肽段Ⅱ、肽段Ⅲ、肽段Ⅳ。

本发明进一步公开了胰岛素质谱肽图的鉴别方法在准确快速鉴别胰岛素真伪（例如以猪胰岛素注射液冒充门冬胰岛素注射液），鉴别胰岛素具体类别（通过各胰岛素的特征质谱肽图对胰岛素种类实现鉴别）方面的应用。实验结果显示：采用本发明的质谱肽图鉴别方法可以准确的鉴别出胰岛素的真伪以及具体类别（见附图1～4）。