[发明专利]一种基于磁分离和酶催化的核酸液相杂交捕获检测方法

说明书

本发明涉及一种核酸液相杂交后进行磁分离捕获并利用生物酶催化底物进行信号放大检测的方法。该方法包含两个核心要素：磁分离和酶催化。磁分离要素通过连接在磁微粒上的探针在磁场力的作用下从液相中捕获核酸杂交后的双链复合体，对目标待测核酸序列进行特异性富集；酶催化要素通过连接在探针上的生物酶催化底物放大信号，实现对目标待测核酸序列存在与否的判定。目标核酸序列即可以是PCR扩增产物，也可以是未经扩增的核酸。本发明的核心价值之一在于，通过配套本发明研制全自动核酸检测装置，可以实现全自动核酸提取、全自动核酸检测的无缝对接，实现完全的核酸全自动检测。

技术领域

本发明涉及到一种核酸液相杂交捕获检测方法。该方法通过磁分离和酶催化两个核心要素实现，其中磁分离通过将磁微粒与杂交探针核酸序列连接，在该探针与目标核酸序列碱基互补形成杂交体后，利用磁场力进行磁微粒的收集，实现从液相中选择性的将目标核酸序列分离和富集的目的。同时另一种或多种与目标核酸序列其他部位互补的核酸探针则与生物酶连接，杂交后将生物酶与目标核酸序列连接在一起，通过酶催化底物显色或发光等途径进行信号放大，可以实现对目标待测核酸序列的高灵敏度、高特异性检测。

背景技术

核酸杂交检测是最早应用的核酸检测手段之一。其原理是核酸变性和复性理论，在变性核酸复性过程中，互补的核苷酸序列(DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA等)通过Watson-Crick碱基两两配对形成非共价键，从而形成稳定的同源或异源双链分子的过程。经典的核酸杂交方法是将DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜载体上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记，在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。

核酸杂交的方法主要包括：DNA印迹杂交(Southern blot)、RNA印迹杂交(Northern blot)、斑点杂交(Dot blot)、原位杂交(FISH)和PCR反向杂交法等。上述核酸杂交方法均需使用固相载体固定目标待测核酸或固定核酸探针，再用带有信号标记的探针与之杂交，从而检测目标核酸序列。固相载体通常需要通过复杂的实验流程才能完成制备，此类实验不仅操作流程繁琐，而且结果判定方式难以统一，无法进行标准化判读，难以实现全自动检测。而且由于固相载体上的核酸序列为不可移动状态，在杂交时与液相中目标核酸分子的接触碰撞几率受到限制，灵敏度受到影响。多种不利因素限制了杂交法在许多场合的应用，比如在体外诊断、食品安全等需要准确、快速、高灵敏度的在统一标准下出诊断结果的领域，杂交法仅占据很小的比例。

在体外诊断和食品安全领域由于PCR和测序法技术成熟度高，实验操作过程可以统一化、标准化等优点，可以在统一的标准下制备成商业化检测试剂盒进行广泛的应用。PCR方法由于循环扩增的逐级放大效应，敏感度较高，但与此对应的，PCR方法对实验条件要求较严格，否则容易引起气溶胶、产物污染等情况发生，导致检测失败，且一旦发生污染事件，实验室需要经过长时间的休整才能恢复。一代测序法周期长费用高、操作步骤繁琐，二代测序法虽然效率和准确度更高，但由于需要经历构建文库、标准化文库等一系列复杂的操作才能完成，应用成本较高，在体外诊断和食品安全领域的广泛应用也面临诸多难题。

基于核酸杂交捕获的方法进行核酸检测相对于二代测序来说简单便捷，抗污染能力强，目前已有商业化的应用。德国凯杰Qiagen公司HC2法HPV核酸检测试剂盒是其中的一个典型代表。该试剂盒是一种基于核酸杂交捕获法检测HPV核酸的方法，通过在酶标板上包被抗核酸抗体，之后加入的反应液中含有待测核酸序列和与之互补的探针核酸序列，二者杂交后形成双链复合物，被酶标板上的抗体捕获，再加入碱性磷酸酶链接的第二抗双链核酸抗体，通过底物发光显色，可以判定目标待测核酸存在与否。国内杭州德同生物有限公司DH2、DH3试剂盒也采用了类似的技术原理检测HPV核酸。