[发明专利]一种基于磁分离和酶催化的核酸液相杂交捕获检测方法

权利要求书

1.一种基于磁分离和酶催化的核酸液相杂交捕获检测方法，其特征在于该方法通过以下路径实现：

(1)根据目标待测核酸序列特征设计两个以上与之碱基互补的杂交探针核酸序列，这些杂交探针分为两组功能，一组用于与磁微粒链接，一组用于与生物酶链接；

(2)制备杂交探针时在探针的5’端或3’端或两端修饰生物素、地高辛、氨基基团中的一种或两种，具体修饰组合包括：5’-生物素，5’-地高辛，5’-氨基，3’-生物素，3’-地高辛，3’-氨基，或以下组合：5’-生物素——3’-生物素，5’-生物素——3’-地高辛，5’-生物素——3’-氨基，5’-地高辛——3’-地高辛，5’-地高辛——3’-生物素，5’-地高辛——3’-氨基，5’-氨基——3’-氨基，5’-氨基——3’-生物素，5’-氨基——3’-地高辛；

(3)根据预先设计好的探针分组，选择与磁微粒连接的探针组，根据该探针组修饰基团的不同，选择能与该修饰基团形成连接作用的修饰有功能基团的磁性微球，将探针链接到磁性微球上，形成磁分离核酸探针；

(4)根据预先设计好的探针分组，选择与生物酶连接的探针组，根据该探针组修饰基团的不同，选择能与该修饰基团对应的链接方法，将该组核酸探针连接到生物酶上，形成生物酶核酸探针；生物酶与探针的结合根据与之连接的探针杂交反应时所处环境条件的不同，可以在杂交前完成连接或者在杂交后连接，避免生物酶受杂交环境影响失活；

(5)将磁分离核酸探针、生物酶核酸探针、目标待测核酸序列进行杂交，杂交的顺序可以是先进行生物酶核酸探针与目标待测核酸序列杂交，再与磁分离核酸探针杂交；也可以是先进行磁分离核酸探针与目标待测核酸序列杂交，再与生物酶核酸探针杂交；也可以是磁分离核酸探针、目标待测核酸序列、生物酶核酸探针同时混合杂交；

(6)杂交后进行磁分离，弃去上清液，保留磁微粒，此时形成“磁分离核酸探针——目标待测核酸序列——生物酶核酸探针”的复合物，与同一目标待测核酸序列杂交结合的磁分离核酸探针序列数量可以是一个或多个序列，与同一目标待测核酸序列杂交结合的生物酶核酸探针序列数量可以是一个或多个序列；

(7)清洗磁微粒后，加入生物酶对应的显色底物或发光底物，即可形成颜色或者发光信号，再由特定的仪器阅读，通过合理设定阳性判断值(Cut-Off value)来确定目标待测核酸序列的存在与否。

2.根据权利要求1所述的磁微粒，其特征是具有一定尺寸的磁性微粒子，平均粒径范围为10纳米至100微米，其物理功能是可以通过磁场力实现聚集；微粒子的形状可以是任意三维空间结构，其表层修饰了功能基团，可以与核酸探针序列上的修饰基团反应。

3.根据权利要求2所述的磁微粒，其表层修饰的功能基团有羧基、氨基、羟基、氯甲基苯基、亲和素、地高辛抗体，其中羧基、氨基、羟基、氯甲基苯基与探针上修饰的氨基连接，亲和素与探针上修饰的生物素连接，地高辛抗体与探针上修饰的地高辛连接。

4.根据权利要求1所述的杂交探针核酸序列，其化学本质是一段核苷酸序列，包括DNA序列和RNA序列，其杂交捕获的目标核酸分子，可以是DNA双链序列中的一条或两条链，或者RNA单链。

5.根据权利要求4所述的杂交探针核酸序列，其序列中可以包含锁核酸碱基(Lockednucleic acid，LNA)，也可以不包含锁核酸碱基。

6.根据权利要求1所述的与目标待测核酸序列杂交的磁分离核酸探针序列数，典型的数量范围为1-100个，优化的数量范围为1～10个，与目标待测核酸序列杂交的生物酶核酸探针序列数，典型的数量范围为1-100个，优化的数量范围为1～10个。

7.根据权利要求1所述的磁分离探针的链接过程，根据杂交探针上修饰的基团不同，其可以在进行核酸杂交之前预先完成链接，也可以在进行核酸杂交过程中链接，也可以在核酸杂交完成后链接。

8.根据权利要求1所述的生物酶，包括辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶ALP，酶上预先链接了特定的功能基团，包括：羧基、氨基、醛基、酰肼基、亲和素、抗地高辛抗体。