[发明专利]一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法

说明书

本发明公开了一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，该哈茨木霉高产菌株通过出发菌株进行紫外诱变、接种发酵瓶、发酵液过滤、平板培养基的准备、抗性筛选的步骤选育得到，根据菌种选育确定的数量，优先选择对马铃薯根腐病致病菌镰刀菌抑菌圈大的菌株进行分离纯化传代，完成哈茨木霉高产菌株的快速筛选。本发明提供的哈茨木霉高产菌株选育方法，可有效提供菌种选育效率，从而缩短菌种选育周期，以前菌种选育要经过6～8代选育，现在仅需3～4代即可完成，时间缩短一半；本发明提高菌种筛选效率和选育优良菌种的准确性，从而为哈茨木霉发酵提供优良的菌种，在防控马铃薯镰刀菌根腐病方面提供了可靠保证。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法。

背景技术

木霉菌是广泛存在于自然界中的一种微生物，木霉属于半知菌门，丝孢目，木霉属，常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉、棘孢木霉、深绿木霉、哈茨木霉、长枝木霉等。其中哈茨木霉的菌丝纤细无色，具分隔，多分枝，分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2～3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形，分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，蓝绿色。

哈茨木霉菌作为一种生防菌可以用来预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌、齐整小核菌等病原菌引起的植物病害。其中由镰刀菌侵染马铃薯引起的根腐病、干腐病、枯萎病是世界性的土传真菌病害，马铃薯根腐病在育苗期和大田生长期均可发病，由多种镰刀菌引起的马铃薯镰刀菌根腐病近几年对马铃薯的生产危害严重，一般发病地块减产13％～35％，严重的成片死亡甚至绝产。马铃薯根腐病的防治一般采用化学杀菌剂进行处理，用化学药剂处理时往往存在残留问题，同时生产田中的镰刀菌不能除根，来年易复发等，因此使用哈茨木霉进行生物防治根腐病处理，环保安全有效，可进行长期防治。

但通过自然选育的哈茨木霉菌株对马铃薯根腐病的致病菌镰刀菌的抑制效果有限，需要较大剂量才能抑制，而且抑制效果有限，因此需要通过技术手段开发选育能提高哈茨木霉代谢产物的高产菌株，提高对马铃薯根腐病的防控效果，还可降低了生产成本。

发明内容

基于以上现有技术，本发明的目的在于提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，本发明提供的哈茨木霉高产菌株选育方法，可有效提供菌种选育效率，从而缩短菌种选育周期，以前菌种选育要经过6～8代选育，现在仅需3～4代即可完成，时间缩短一半；本发明提高菌种筛选效率和选育优良菌种的准确性，从而为哈茨木霉发酵提供优良的菌种，在防控马铃薯镰刀菌根腐病方面提供了可靠保证。

本发明所用的出发菌株哈茨木霉菌M-17，保藏编号：CCTCC NO：M2018538，拉丁文名称为Trichoderma harzianum M-17，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018 年8月13日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

本发明采用的技术方案为：一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，包括以下步骤：

步骤一，孢子悬浮液制备：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上进行培养，结束后用生理盐水冲洗菌种斜面，经玻璃珠打散，去除菌丝，得到含有孢子的悬浮液；

步骤二，紫外诱变：将步骤一得到的含有孢子的悬浮液置于平底培养皿中，进行紫外诱变；

步骤三，平板分离筛选：接着将步骤二诱变后的悬浮液稀释后涂布于PDA培养基平板，黑暗条件下，25～28℃培养，待长出菌落后，挑选出菌落形态发生变化的菌株，进行单菌落划线分离，经二次分离纯化得到较纯的诱变菌株；

步骤四，接种发酵瓶：将步骤三得到的诱变菌种在无菌室内采用挖块接种法接于发酵瓶，将发酵瓶放入摇床上振摇，培养结束后，将发酵到终点的发酵瓶进行过滤，取其过滤液；