[发明专利]一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法

权利要求书

1.一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，孢子悬浮液制备：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上进行培养，结束后用生理盐水冲洗菌种斜面，经玻璃珠打散，去除菌丝，得到含有孢子的悬浮液；

步骤二，紫外诱变：将步骤一得到的含有孢子的悬浮液置于平底培养皿中，进行紫外诱变；

步骤三，平板分离筛选：接着将步骤二诱变后的悬浮液稀释后涂布于PDA培养基平板，黑暗条件下，25～28℃培养，待长出菌落后，挑选出菌落形态发生变化的菌株，进行单菌落划线分离，经二次分离纯化得到较纯的诱变菌株；

步骤四，接种发酵瓶：将步骤三得到的诱变菌种在无菌室内采用挖块接种法接于发酵瓶，将发酵瓶放入摇床上振摇，培养结束后，将发酵到终点的发酵瓶进行过滤，取其过滤液；

步骤五，平板的培养基的准备：将PDA培养基预热融化，在无菌室内倒入平板内，待培养基凝固后，再倒入内含敏感菌的检定培养基；

步骤六，抗性筛选：用进样器吸取发酵液的过滤液直接点在含敏感菌的检定培养基上，每两个点样之间距离大于20mm，所有样品点完后，将平板培养基放入培养箱中进行培养，黑暗条件下25～28℃培养8～10d；

步骤七，将步骤六培养8～10d的平板从培养箱中取出，对每个抑菌圈进行测量，根据菌种选育确定的数量，优先选择抑菌圈大的菌株进行确认，完成哈茨木霉高产菌株的快速筛选。

2.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，其特征在于，步骤一和步骤三中PDA培养基斜面和平板制作方法为：

1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；

2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；

3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却倒斜面和平板，凝固后备用。

3.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，其特征在于，步骤一中斜面培养条件为黑暗条件下，25～28℃培养5～7d后。

4.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，其特征在于，步骤二中紫外诱变条件为孢子在15W紫外灯垂直距离下30cm放置，同时磁力搅拌照射30～180s。

5.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，其特征在于，步骤四中发酵瓶配方为碳源添加量为2％的小麦粉、玉米粉、马铃薯全粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉和麸皮粉中的一种或几种；氮源添加量为2％的黄豆粉、葡萄酒皮渣粉、硝酸铵、尿素、硫酸铵和硝酸钠中的一种或几种；生长促进剂为甘草和板蓝根浸出液中的一种或几种，浓度分别为30％、50％、70％。

6.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，其特征在于，步骤四中发酵瓶培养条件为摇床转速220rpm，培养温度25～28℃，培养时间120～168h。

7.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，其特征在于，步骤五中将PDA培养基预热融化时控制培养基厚度在2～3mm之间。

8.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，其特征在于，步骤五中控制内含敏感菌的检定培养基的厚度在2～3mm之间。

9.根据权利要求1所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，其特征在于，步骤五中检定培养基中的敏感菌为尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌中的一种或几种。

10.根据权利要求5所述的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，其特征在于，发酵瓶配方为碳源添加量为2％的玉米粉和麸皮粉中的一种；氮源添加量为2％的黄豆粉和葡萄酒皮渣粉中的一种；生长促进剂为甘草和板蓝根浸出液中的一种或几种，浓度分别为30％、50％、70％。