[发明专利]鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针

说明书

本发明提供一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT‑PCR引物及探针，属于生物技术领域。本发明设计了一对针对裂谷热病毒L基因的特异性检测引物L‑F、L‑R及一条荧光探针L‑P，一对针对裂谷热病毒S片段的特异性检测引物S‑F、S‑R及一条荧光探针S‑P，并优化了该方法的特异性引物及荧光探针的浓度和反应条件。本发明提供的双重荧光定量RT‑PCR方法可以检测裂谷热病毒的感染，同时可以鉴别裂谷热病毒野生株和NSs缺失株(包括Clone 13及其他缺失株)，从而将感染动物同被免疫过的动物区分开来。具有操作简单、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，不仅可以节约成本，还可以为疫情检测和控制争取到宝贵的时间。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针。

背景技术

裂谷热(Rift valley fever，RVF)是由裂谷热病毒(Rift valley fever virus，RVFV)引起的急性出血性人兽共患病，该病主要发生于绵羊、山羊、牛和骆驼，也可以传染给啮齿动物和人。裂谷热病毒主要经蚊虫传播，也可通过接触感染或者发病动物的血液、体液、分泌排泄物等被感染。动物感染裂谷热的重症症状为发热、厌食、流涕、急性腹泻、黄疸，羔羊和犊牛死亡率高达90％，怀孕母羊和母牛流产率高达80-100％。人感染后通常无症状或者症状较轻，少于5％的病人发展为综合征，如急性肝炎、出血热或者脑炎。世界动物卫生组织(OIE)将裂谷热列为必须报告的疫病，我国将其列为一类传染病。裂谷热病毒属于布尼病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒属(Phlebovirus)，为单股负链RNA病毒，基因组可分为L(大)、M(中)、S(小)三个节段。其中S节段采取双义编码的方式，编码核蛋白N和非结构蛋白NSs。M节段编码两种囊膜糖蛋白，以及NSm和未知功能的结构蛋白。L节段序列高度保守，编码RNA依赖的病毒聚合酶。

裂谷热最初主要在非洲撒哈拉以南地区周期性流行，2000年向北蔓延到阿拉伯半岛，引起也门和沙特阿拉伯的疫情大爆发。2016年，我国发现首例输入性裂谷热病例，警示该输入性传染病已对我国的公共卫生安全构成了现实性的威胁。因此，建立一种快速准确的针对裂谷热病毒的诊断技术方法，对于加强我国对裂谷热病毒的检测，严格控制裂谷热的输入有现实意义。

目前，国际上还没有人用的裂谷热商品化疫苗，仅有少量兽用疫苗被批准，包括灭活疫苗和弱毒活疫苗。其中，Clone 13弱毒活疫苗已在南非和津巴布韦获批，该NSs缺失株主要毒力因子NSs基因中含有大量缺失。灭活疫苗虽然安全，但须重复增加剂量；弱毒活疫苗虽然免疫原性较高，但存在毒力回归的生物安全隐患。有研究者建立了RVFV的T7RNA聚合酶驱动的反向遗传系统，构建NSs单独缺失和NSs/NSm同时缺失的特异性弱毒株，它的毒力比目前可用的弱毒株Clone 13、MP-12和Smithburn更弱，且可以同野生毒株区分开来。这种弱毒株具有成为裂谷热疫苗的巨大潜力。因此，我们选择病毒L基因保守区域以及NSs缺失部位设计相应的引物和探针，建立双重荧光定量RT-PCR方法。该方法在快速检测裂谷热病毒的感染的同时，将能够用于区分基因缺失的疫苗毒株和野毒株，进行鉴别诊断。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针。本发明提供的双重荧光定量RT-PCR引物及探针可以检测和鉴别裂谷热病毒野生株和NSs基因缺失株。

技术方案

本发明分别设计了一对针对裂谷热病毒的通用检测引物L-F、L-R及一条荧光探针L-P，一对针对野生株的特异性检测引物S-F、S-R及一条荧光探针S-P，并确定了该方法的特异性引物及荧光探针的浓度。具体为：

一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针，其特征在于，所述检测裂谷热病毒的通用检测引物及探针的序列分别为：