[发明专利]鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针

权利要求书

1.一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针，其特征在于，所述检测裂谷热病毒的通用检测引物及探针的序列分别为：

上游引物L-F：5’-TGACATACAAGGAGCATCTGAAA-3’；

下游引物L-R：5’-GCCAAAGGTGAAATCGTGAAC-3’；

荧光探针L-P：5’–JOE-AGGCTCAACTTTGCTACCCTCCAT-TAMRA-3’；

检测裂谷热病毒非基因缺失株的特异性检测引物及探针的序列分别为：

上游引物S-F：5’-AGGATGATAGTGACCGAGGCT-3’；

下游引物S-R：5’-AATGAGGGCTGAGTTTGGAA-3’；

荧光探针S-P：5’–FAM-CCTCAGAGGGATTGACCTGTGCCTGTTGCCA-TAMRA-3’。

2.用权利要求1所述的引物及探针制备的鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR试剂盒。

3.权利要求1所述的引物及探针在鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR中的应用，该应用仅限于诊断疾病以外的应用，其特征在于，

(1)合成权利要求1所述的引物及探针；

(2)质粒标准品的制备：将包含登录号为HE687307.1的裂谷热病毒S片段和登录号为HE687305的L片段进行基因合成，并克隆至载体pMD19-T中制成阳性质粒，即为标准品，将标准品10倍梯度稀释至:1×10⁸-1×10¹拷贝/μl，储存于-20℃备用；

(3)待测模板的制备：将包含登录号为HE687307.1的裂谷热病毒S片段和登录号为HE687305的L片段进行基因合成，并克隆至表达载体pcDNA3.1中，转染至293T细胞，收获细胞裂解液用于制备阳性模板；

取100μl血清或细胞裂解液，或取100mg组织样品，加入500μl PBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，12000rpm离心10分钟，取上清液100μl，加入400μl TRIzol试剂，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，加入100μl氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，室温孵育30分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，RNA沉淀于管底，加入500μl DEPC处理的水配置的75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5分钟，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10分钟，用20μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；

(4)进行双重荧光定量RT-PCR反应：裂谷热病毒双重荧光定量RT-PCR方法的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有裂谷热病毒核苷酸则显示FAM和JOE阳性扩增曲线；若待检样品中含有裂谷热NSs缺失株核苷酸则显示JOE阳性扩增曲线，FAM无扩增信号；若待检样品中不含有裂谷热病毒核苷酸则均无扩增信号。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述双重荧光定量RT-PCR检测体系具体包括：

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述双重荧光定量RT-PCR反应的反应条件为：42℃5min；95℃10s；95℃5s、60℃34s，40个循环。